VALORACIÓN SEMINAL. CITÓMETRO DE FLUJO

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María Jesús Revuelta Vargas
hace 8 años
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1 . CITÓMETRO DE FLUJO 1

2 VALORACIÓN DE LA VIABILIDAD ESPERMÁTICA MEDIANTE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE FLUJO En las últimas dos décadas, la citometría de flujo se ha convertido en una técnica importante gran utilidad en la evaluación espermática y es cada vez más utilizada tanto para la evaluación de rutina como para la investigación en ciencia veterinaria (Martínez-Pastor y cols.,2010). Se han desarrollado muchos métodos de tinción y combinación de fluorocromos que permiten analizar una gran variedad de funciones espermáticas. 2

para la evaluación de rutina como para la investigación en ciencia veterinaria (Martínez-Pastor y cols.,2010).

3 VALORACIÓN DE LA VIABILIDAD ESPERMÁTICA MEDIANTE LA TÉCNICA DE CITOMETRÍA DE FLUJO Entre las características espermáticas más comúnmente analizadas para el control de la calidad del semen equino, se incluyen el estudio de la viabilidad espermática, integridad del acrosoma, la funcionalidad mitocondrial, estado de capacitación espermática, marcadores de apoptosis, marcadores de estrés oxidativo, valoración de la actividad mitocondrial y daño en el ADN (Mata-Parra, 1997; Martínez-Pastor y cols., 2010). 3

integridad del acrosoma, la funcionalidad mitocondrial, estado de capacitación espermática, marcadores de apoptosis,

4 VALORACIÓN SEMINAL El estudio de la viabilidad espermática se basa en el análisis de la integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides, mediante el uso de dos fluorocromos combinados. Uno de ellos es capaz de penetrar la membrana plasmática dañada o degenerada, y por lo tanto, permite identificar las células muertas o en proceso de degeneración. Mientras que el otro es capaz de atravesar membranas celulares intactas, y por lo tanto, permite identificar poblaciones celulares vivas. 4

Uno de ellos es capaz de penetrar la membrana plasmática dañada o degenerada, y por lo tanto, permite identificar las

5 El yoduro de propidio (IP) es el más utilizado para identificar células muertas. Éste compuesto penetra en el espermatozoide con la membrana dañada; se une de forma estequiométrica al ADN de doble cadena, donde se intercala entre la doble hélice y, al ser excitado por la longitud de onda apropiada (636 nm), emite fluorescencia roja (Graham, 2001; Martínez-Pastor y cols.,2010). 5

estequiométrica al ADN de doble cadena, donde se intercala entre la doble hélice y, al ser

6 En relación a la identificación de poblaciones de células vivas, se describe al grupo de la carboxifluoresceína. Son compuestos que, al penetrar la membrana celular y, al ser excitados a una longitud de onda determinada (488nm), emiten fluorescencia verde, quedando retenidos intracelularmente por la membrana. Una de las combinaciones para identificar espermatozoides vivos-muertos es la utilización de yoduro de propidio en unión con fluorocromos del grupo de las carboxifluoresceínas. 6

fluorescencia verde, quedando retenidos intracelularmente por la membrana.

7 VALORACIÓN SEMINAL los espermatozoides totalmente viables son los verdes, en los que no aparece ningún rastro de rojo. En la mayoria de los estudios, aparece una subpoblación de espermatozoides que si bien son verdes, también son rojos. Es decir, una subpoblación de espermatozoides que puede tener comprometida su supervivencia. 7

En la mayoria de los estudios, aparece una subpoblación de espermatozoides que si

8 Las sondas más utilizadas en la impermeabilidad de la membrana para determinar la viabilidad espermática son el yoduro de propidio y el homodímero de etidio, ya que estos son rápidos en reaccionar y fáciles de usar, y pueden ser excitados (488nm) en la mayoría de citómetros de hoy día. 8

homodímero de etidio, ya que estos son rápidos en reaccionar y fáciles

9 Cuadrantes de las sub-poblaciones espermáticas sometidas a tinciones dobles de Yoduro de Propidio y Hemodímero de Etidio. Espermatozoides con apoptosis tardía. Cuadrante E1 Espermatozoides necróticos. Cuadrante E2 Espermatozoides vivos. Cuadrante E3 Espermatozoides con apoptosis temprana. Cuadrante E4 9

10 VALORACIÓN DE LA SUSCEPTIBILIDAD ESPERMÁTICA AL ESTRÉS OXIDATIVO Durante la congelación y descongelación, el esperma sufre daños oxidativos y osmóticos que pueden cambiar la estructura lipídica de la membrana. Estos cambios conducen a la muerte espermática o modificaciones subletales que reducen la viabilidad de la población espermática tras la descongelación. 10

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