Crioprotectores. Dimetilsulfóxido (DMSO)

Transcripción

1 Crioprotectores Dimetilsulfóxido (DMSO) Crioprotectores coligativos previenen la deshidratación y disminuyendo la cantidad de agua absorbida por los cristales de hielo. El DMSO es ligeramente tóxico. Atraviesa rápidamente las membranas celulares

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3 Proteínas Crioprotectores. Aumentan la supervivencia de las células cuando se agregan a la solución crioprotectora. Modifican la viscosidad y la temperatura de la transición de la solución crioprotectora. La fuente puede ser autóloga.

4 Soluciones crioprotectoras Hidroxietilalmidón (HES) Sustancia polimérica con cadenas de diferentes pesos moleculares que no penetra la célula de forma libre. Protege a la célula formando una capa viscosa y hialina que retarda el movimiento de agua.

5 Almacenamiento Congeladores mecánicos C a -86 C. Congelador de nitrógeno líquido C a -142 C.

6 Velocidad de congelación DMSO al 10 %. controlada. Concentración celular 50x10 6 /ml. Velocidad inicial de -1 C/min. En -40 C incrementar a -10 C/min. En -80 C colocar en la fase gaseosa de nitrógeno líquido hasta -146 C.

7 Velocidad de congelación no controlada DMSO al 5 % con HES al 6 %. Concentración celular menor a mm3. Colocar en bolsas de almacenamiento en un congelador mecánico a -80 C. En los -80 C incrementar a C/min la velocidad hasta -146 C. Almacenar en la fase gaseosa de nitrógeno líquido.

8 Ventajas de la congelación no Menor costo. controlada Menor tiempo técnico. El HES previene la lisis de granulocitos durante el descongelamiento. Usando DMSO al 5% disminuyen las reacciones tóxicas durante la infusión. Sencillo. Menos espacio en el congelador.

9 Protocolo B = 1 C/min Protocolo D = 1.8 C/min

10 Congelación

11 Congelación

12 Congelación

13 Descongelación

14 Descongelación

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17 Control de calidad de la Valoración in vitro. criopreservación. Conteo (citometría) (tasas de recuperación de células mononucleares, CD34 +, eritrocitos y PMN). Prueba de viabilidad por exclusión de tinción (con azul de trípano o yoduro de propidio). Cultivo de CFU-GM.

18 Citometría de Flujo

19 Citometría de flujo (CF) Es una técnica multiparamétrica que permite estudiar propiedades físicas y biológicas de las células vivas en una suspensión fluida. El citómetro es un aparato capaz de medir varios parámetros celulares a partir de una suspensión celular por medio de la interacción de las células con un haz de luz láser guiadas mediante un flujo contínuo.

20 Parámetros celulares que pueden estudiarse Contenido de ADN Parámetros nucleares Tamaño Complejidad citoplasmática Parámetros estructurales Proteinas intracelulares Actividad enzimática Proteinas de superficie Parámetros superficiales Parámetros extracelulares Parámetros citoplasmáticos Proteinas secretadas Interacción con otras cél.

21 Esquema del citómetro Fluídos Detectores FL3 PerCP, Cy5 Sistema electrónico FL2 PE FL1 FITC SSC Láser 488nm Sistema óptico FSC

22 Tipos de señales Señales de dispersión Señales de fluorescencia

23 Tipos de señales Señales de dispersión Detector de SSC L A S E R Detector de FSC Detector de FSC Detector de SSC

24 Inmunomarcación Anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo

25 Tipos de señales Señales de fluorescencia Detector de SSC Detector de FL2 Detector de FL3 L A S E R Detector de FSC Detector de FSC Detector de SSC Detector de FL1 Bioq. Andrea Novoa - Laboratorio de Citometría de Flujo - Servicio de Hematología

26 Características de la CF Técnica sencilla y rápida Alta especificidad Multiparamétrica FSC y SSC FL1, FL2 y FL3 (un láser) ó FL1, FL2, FL3 y FL4 (dos láseres)

27 Fluorocromos Son moléculas químicas que absorben luz a una determinada longitud de onda y emiten a otra diferente. FITC en FL1 (Isotiocianato de fluoresceina) PE en FL2 ( Ficoeritrina) PerCP en FL3 (piridin clorofil proteina) APC en FL4 (aloficocianina)

28 Espectros de emisión

29 Procesamiento de la muestra Marcación de superficie Células en suspensión + Acs. Monoclonales* Lisis con Cloruro de amonio Resuspender Incubar 20 en oscuridad Centrifugar 5 a 1800rpm Adquisición de la muestra

30 Distribución de las células de una muestra de sangre normal Complejidad citoplasmática Tamaño celular

31 Distribución de las células de una muestra de médula ósea normal Eosinófilos SSC Granulocitos Monocitos Linfocitos Céls. Rojas nucleadas CD45 PERCPCY5,5 -> CD45 PerCP Precursores CD34+

32 GB mm 3 CD % CD % GB mm 3 CD % CD % Stem cell

33 GB mm 3 CD % CD % GB mm 3 CD % CD % Stem cell

34 El recuento de células CD34+ es necesario para determinar las dosis requeridas en los transplantes de células progenitoras La Citometría de Flujo provee una metodología cuantitativa rápida y reproducible para la identificación y enumeración de células CD34+

35 Trypan Blue El método de exclusión Trypan Blue es ampliamente utilizado en laboratorios para la determinación de viabilidad; solamente penetra en células cuyas membranas plasmáticas estén dañadas. Las membranas de células viables no se tiñen con el colorante pues son impermeables al mismo, y las células teñidas y las no teñidas se visualizan con un microscopio.

36 Trypan Blue

37 CULTIVO CELULAR -Método Funcional

38 IMDM Recolección + IMDM FICOLL + STEM STEM FICOLL 400 G 30` GRD+Neutrof

39 AGAR STEM + IMDM 2 LAVADOS IMDM X 2 Resuspensión Recuento 1x 10 6 Suero Bovino Fetal Células Medio Cultivo STEM + Mononucleares

40 Mezcla + FEC-G Mezcla + FEC-G Mezcla sin FEC-G Estufa 37º C Humidificada, CO2 al 5% durante 10 dias Leer microscopio invertido Microcolonias + 4 C / Colonias entre C

41 Efectos asociados a la infusión

42 Efectos asociados a la infusión de CPH. Los efectos colaterales de la infusión de CPH se minimizan reduciendo el volumen total y las células rojas infundidas. Los métodos al seleccionar mejor las celulas disminuyen los efectos colaterales y mejoran la velocidad de respuesta del injerto.

43 ehheh. Qué hay de nuevo, viejo? Gracias