Enfermedad residual mínima por Citometría de Flujo Multiparamétrica en Leucemia Linfocítica Crónica
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- Joaquín Ayala Mora
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1 72º CONGRESO ARGENTINO DE BIOQUÍMICA, ABA 22 al 25 de agosto de 2017, CABA, Enfermedad residual mínima por Citometría de Flujo Multiparamétrica en Leucemia Linfocítica Crónica Evangelina Agriello Bahía Blanca
2 UTILIDAD DE LA EMR EN LLC Evaluar la respuesta a la terapia Identificar la cinética de la depleción tumoral Identificar la recaída Surrogate en ensayos clínicos y post transplante alogénico
3 Objetivo ACTUAL alcanzado por los Métodos de análisis de la EMR Erradicación Erradicación completa completa de de la la LLC Remisión clínica con ausencia de EMR en sp y mo <1 célula de LLC en leucocitos normales
4 Requerimientos actuales de los Métodos PARA LA DETERMINACION de la EMR Alta específicidad Alta sensibilidad Independiente del tratamiento Alta reproducibilidad interlaboratorio ESTANDARIZABLE
5 Métodos actuales de análisis de EMR ASO IGH RQ-PCR Citometría de flujo
6 Análisis comparativo de Citometría de flujo vs ASO IGH RQ PCR gcllsg cll8 TRIAL CF & PCR demuestran ser comparables para la cuantificación de EMR con una sensibilidad de 10-4 PCR alcanza menores valores de EMR (<10-4 ) Bottcher et al.,leukemia, 2009
7 ASO IGH RQ-PCR Diseño paciente específico Muy laborioso Alto costo Análisis de cada paciente al diagnóstico
8 APLICABILIDAD TECNICA DE EMR Técnica ASO IGH RQ-PCR Citometría de Flujo Multiparamétrica Sensibilidad analítica Aplicabilidad ~80% >90% Experiencia Costo ++ + Tiempo de proceso semanas 1 o 2 días
9 APLICABILIDAD TECNICA DE EMR
10 It is an independent scientific consortium that aims at innovation and standardization of flow cytometric immunophenotyping to further improve and progress diagnostic patient care JJM Van Dongen and A Orfao. Leukemia (2012) 26,
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12 Citometría de Flujo Multicolor (8 colores) con Estandarización técnica completa Seteo del instrumento Protocolos de Inmunofenotipificación (SOPs) Paneles que definen diagnósticos precisos Desarrollo de nuevo software: Combinación de multiples tubos: cálculo y vista APS Mapeo de muestras de leucemias de diagnóstico y follow-up contra templados de muestras normales/control Desarrollo de protocolos a 8-colores para diagnóstico, clasificación y monitoreo de enfermedades hematológicas Paneles diseñados para contester una pregunta clínica específica JJM Van Dongen and A Orfao. Leukemia (2012) 26,
13 INSTRUMENT CONFIGURATION FACSCANTO II, 3 LASERS (4-2-2), BECTON DICKINSON VIOLET LASER 425/50 525/ nm Pacific Blue Pacific Orange BD Horizon V450 BD Horizon V500 BLUE LASER 530/30 576/26 695/40 780/60 488nm FITC PE PerCP-Cy5.5 Pe-Cy7 RED LASER 660/20 780/60 633nm APC APC H7
14 Standard Operating Protocol SOP PARA EL SETEO DEL INSTRUMENTO 50ul SP+2ml FACS Lysing + lavado con PBS BSA Seteo de FSC y SSC (FACSDiVa software) Umbral: fijo a Ajustar el voltaje para lograr el valor target medio para la ventana de la población linfoide FSC:55000 (rango: ) SSC: (rango: )
15
16 Linfocitos T CD4+ APS Automatic Population Separator 12 archivos fusionados de 2 centros CD20+4/CD45/L+CD8/K+CD56/CD5/CD19/CD3/CD38 MFI (CV < 15%) Linfocitos B CD19+ LT CD4 Monocitos Linfocitos T CD8+ M2 M3 M4 M5 M6 LT CD8 Monocitos M1 Centro A Centro B FSC SSC FL1 FL2 FL3 FL4 FL3 FL6 FL7 FL8
17 Results of the Euroflow QA programme 6th round, on May 2015 CD5 CD19 CD5 CD19 CD8 T cell CD4 T cell B cell CD8 T cell CD4 T cell B cell
18 Panel standard International Diseño de combinaciones de marcadores dirigidos contra el fenotipo aberrante de las 4 colores consumen tiempoleukemia (2007) 21, células patológicas κ λ CD19 CD5 CD20 CD38 CD19 CD5 CD81 CD22 CD19 CD5 CD43 CD79b CD19 CD5 CD45 CD14 CD19 CD3 La menor variabilidad interlaboratorio entre las combinaciones testeados Marcadores troncales Control de contamination: LT y Mo Determina el límite de detección Rawstron et al., Leukemia, 2007
19 ericll.org/projects 4 colores κ λ CD19 CD5 CD20 CD38 CD19 CD5 discriminación de LLC de linfocitos B CD81 CD22 CD19 CD5 normales CD43 CD79b CD19 CD5 CD45 CD14 CD19 CD3 6 colores CD19/CD5/CD20/CD3/CD38/CD79b CD19/CD5/CD20/CD81/CD22/CD43 8 colores CD19/CD5/CD20/CD3/CD81/CD79b/CD22/CD43 Leukemia (2013) 27,
20 ERICLL 4 colores κ λ CD19 CD5 CD20 CD38 CD19 CD5 discriminación CD81 CD22 CD19 CD5 de LLC de CD43 CD79b CD19 CD5 linfocitos B CD45 CD14 CD19 CD3 normales 6 colores CD19/CD5/CD20/CD3/CD38/CD79b CD19/CD5/CD20/CD81/CD22/CD43 8 colores CD19/CD5/CD20/CD3/CD81/CD79b/CD22/CD43 TUBE BV421 BV510 FITC PE PerCP- Cy5.5 PECy7 APC APC- C750 v7-1 CD27 CD3 CD79b CD5 CD22 CD19 CD200 CD81 v7-2 CD27 CD3 CD79b CD5 CD20 CD19 ROR1 CD81
21 Conclusión Aunque ASO IGH RQ- PCR logra mayor sensibilidad de detección (hasta1cel tumoral en 10 6 leucocitos), requiere mas tiempo, muestra al diagnóstico y ensayo paciente específico CFM es la técnica recomendada para EMR por las sgtes razones: bajo costo menor tiempo de procesamiento un marcador de entidad, NO paciente específico Mas colores, menos células, menos reactivos,...analisis más simple con Técnicas estandarizadas
22 Gracias!!
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