LYMPHOCLONAL 9 (CD8 + smigλ -FITC / CD56 + smigκ PE / CD4 + CD19 PerCP-Cyanine5.5 / CD3-PE-Cyanine7 / CD20 APC / CD45-APC-C750)

Transcripción

1 LYMPHOCLONAL 9 (CD8 + smigλ -FITC / CD56 + smigκ PE / CD4 + CD19 PerCP-Cyanine5.5 / CD3-PE-Cyanine7 / CD20 APC / CD45-APC-C750) Ref: CYT-LC9 Para uso en investigación USO PROPUESTO Lymphoclonal 9 es un reactivo de uso en citometría de flujo diseñado para la determinación en sangre periférica, médula ósea y otros fluidos corporales de las principales subpoblaciones de linfocitos entre las que se incluyen los linfocitos T totales (CD3+), los linfocitos B totales (CD19+CD20+), las células agresoras naturales (NK del inglés natural killer) (CD3-CD56+), las subpoblaciones de linfocitos T cooperadores (CD3+CD4+) y citotóxicos (CD3+CD8+), y las subpoblaciones de linfocitos B con inmunoglobulinas con cadenas ligeras kappa (CD19+ Igκ+) y lambda (CD19+ Igλ+). Este reactivo de inmunofluorescencia directa de 6 colores puede utilizarse en la evaluación de diversas condiciones clínicas sospechosas como presencia de linfocitosis, nódulos linfoides aumentados, citopenias sin causa aparente, etc. GENERALIDADES La detección de linfocitos maduros clonales fenotípicamente aberrantes tiene un papel relevante en el diagnóstico y clasificación de los síndromes linfoproliferativos crónicos (SLPC), tanto en los derivados de linfocitos B, T como NK. En las neoplasias de linfocitos B maduros el estudio fenotípico desempeña un papel fundamental a la hora de definir la entidad maligna. La Citometría de Flujo (CF) es una herramienta importante en la caracterización analítica y cuantitativa de células por su capacidad de ofrecer información simultánea, rápida y cuantitativa de varios parámetros de cada una de las células que constituyen la muestra a analizar. La citometría de flujo requiere suspensiones celulares que se incuban con anticuerpos marcados de forma fluorescente y que están dirigidos contra proteínas celulares específicas. El citómetro de flujo detecta las señales de fluorescencia del complejo antígenoanticuerpo marcado con el fluorocromo, de forma que la intensidad de fluorescencia de las células marcadas es proporcional a la cantidad de sitios antigénicos presentes en la célula. Lymphoclonal 9 reconoce por citometría de flujo los antígenos CD45, CD3, CD56, CD4, CD8, CD20, CD19 y las cadenas ligeras kappa y lambda presentes en las distintas subpoblaciones de linfocitos, y por tanto puede utilizarse en los estudios de caracterización inmunofenotípica de linfocitos. Estos estudios se utilizan habitualmente en la caracterización y seguimiento de diferentes enfermedades hematológicas (1-5). El tándem APC-C750 es un fluorocromo con un pico de emisión máxima a 779nm que aporta por citometría una señal brillante, poco ruido de fondo y alta fotoestabilidad. Cuando se excita con el láser rojo, el APC transfiere energía a la molécula C750 logrando una emisión en una longitud de onda más lejana. Para la utilización combinada de anticuerpos conjugados con APC y con APC-C750 el citómetro debe estar equipado con un láser rojo y se recomienda un filtro de banda de 780/60nm. PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO La Citometría de Flujo (CF) es una técnica de análisis celular multiparamétrica cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas, generalmente células, alineadas de una en una por delante de un haz de luz láser. La interacción de las células con el haz de luz genera señales de dos tipos: la generada por la dispersión de la luz (FSC/SSC) y la relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula. Estas señales se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales que se procesan en el ordenador. Cuando se añade el reactivo a la muestra, los anticuerpos marcados con fluorocromos presentes en el reactivo se unen de forma específica a los antígenos frente a los que están dirigidos, permitiendo la detección por CF de las distintas subpoblaciones linfocitarias. La población de eritrocitos, que podría dificultar la detección de la población de interés, se elimina usando una solución lisante de hematíes previa a la adquisición de la muestra en el citómetro. El recuento de las subpoblaciones linfocitarias generalmente se expresa como número de células marcadas por microlitro (recuento absoluto) o como porcentaje de células marcadas respecto al total de linfocitos o leucocitos presentes en la muestra. Es recomendable seguir el procedimiento operativo de calibración definido por EuroFlow para ajustar las condiciones del citómetro (6). COMPOSICIÓN DEL REACTIVO CYT-LC9 contiene volumen suficiente para 25 determinaciones (50µL de reactivo por 10 6 células). El kit incluye los siguientes viales: 5 viales liofilizados con la siguiente mezcla de 9 anticuerpos conjugados con fluorocromo. Cada vial liofilizado contiene cantidad suficiente para 5 determinaciones. Fluorocromo FITC PE PerCP-Cyanine5.5 PE- Cyanine7 APC APC-C750 Marcador CD8 smigλ CD56 smigκ CD4 CD19 CD3 CD20 CD45 Clon UCHT-4 Policlonal C5.9 Policlonal SK3 HIB19 UCHT-1 2H7 HI30 Isotipo IgG2a IgG2b IgG1 IgG1 IgG1 IgG2b IgG1 Reactividad Cél T citotóxica Cadenas ligeras Lambda Cél NK Cadena ligera Kappa Cél T cooperador Cél B Cél T Cél B Leucocitos Además se incluye viales del anticuerpo anti CD45-APC-C750 y CD3 PE-Cyanine7 humano por si el usuario necesita realizar compensación de fluorescencias del citómetro. Los reactivos se suministran con azida sódica (NaN 3) al 0.1% y no son considerados estériles. Pág. 1 de 5 Última revisión: 05/05/2016

2 CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Los componentes del kit Lymphoclonal 9 son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta cuando se almacenan a una temperatura de 2-8ºC. La fecha de caducidad aplica a los viales liofilizados. Los viales con la combinación de 9 anticuerpos premezclados son estables durante un mes una vez que han sido reconstituidos. Los viales no se deben congelar ni exponer a luz directa durante el almacenamiento o la incubación con las células. Deben mantenerse secos y una vez abiertos, almacenarse en posición vertical para evitar posibles derrames. RECONSTITUCIÓN Reconstituir cada vial liofilizado con 300µL de agua destilada. Se usan 50µL de esta solución por determinación. El volumen del vial reconstituido que no se utilice es estable durante un mes, si se almacena a 2-8ºC. ADVERTENCIAS Y RECOMENDACIONES 1. Para uso en investigación. 2. Si se alteran los componentes por adición de otros, estos cambios deben ser validados por el usuario. 3. El kit es estable durante el periodo de tiempo indicado en la fecha de caducidad cuando se almacena apropiadamente. No debe utilizarse después de la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Si se almacena en condiciones diferentes a las especificadas, tales condiciones deben ser validadas por el usuario. 4. Alteraciones en la apariencia de los componentes, como la presencia de precipitados o cambios de color, son indicativos de inestabilidad o deterioro. En esas condiciones el kit no debe ser utilizado. 5. Contiene azida sódica 0.09% (p/v) (CAS-Nr ) como conservante, pero aún así se debe tener cuidado para evitar la contaminación bacteriana del reactivo puesto que en esas circunstancias podrían obtenerse resultados incorrectos. Indicaciones de peligro: H302 Nocivo en caso de ingestión Indicaciones de prudencia: P264 Lavarse concienzudamente tras la manipulación. P270 No comer, beber ni fumar durante su utilización. P301+P312 En caso de ingestión, llamar a un CENTRO de información toxicológica o a un médico en caso de malestar. P301+P330 P501 En caso de ingestión, enjuagarse la boca. Eliminar el contenido/el recipiente de conformidad con la normativa local, regional, nacional o internacional. 6. Todas las muestras biológicas y los materiales con los que estén en contacto deben considerarse como riesgos biológicos. Se recomienda su manipulación como sustancias capaces de transmitir infecciones (7) y desecharse con las precauciones reglamentarias establecidas para este tipo de productos. Se recomienda su manipulación con ropa y guantes protectores apropiados y su uso por personal suficientemente cualificado para las técnicas descritas. Evitar el contacto de las muestras con la piel y las membranas mucosas, en caso de contacto lavar inmediatamente con abundante agua. 7. La utilización de los componentes usando tiempos de incubación o temperaturas diferentes a las recomendadas pueden provocar resultados erróneos. Cualquiera de estos cambios deben ser validados por el usuario. PROCEDIMIENTO Material suministrado El kit CYT-LC9 contiene volumen suficiente para 25 determinaciones (50µL de reactivo por 10 6 células). El kit incluye los siguientes viales: 5 viales liofilizados con la mezcla de 9 anticuerpos conjugados con fluorocromo, Además se incluyen viales del anticuerpo anti CD45-APC-C750 y CD3-PE-Cyanine7 por si el usuario necesita realizar compensación de fluorescencias del citómetro. Los requerimientos de compensación del APC-C750 son equivalentes a los APC-H7. Material requerido pero no suministrado Citómetro de Flujo equipado con láser de ion argón de 488nm, láser rojo de 633, filtro de banda de 780/60nm, ordenador y software asociado. Tubos de ensayo adecuados para la adquisición de las muestras en el citómetro de flujo utilizado. Habitualmente se utilizan tubos con fondo redondo de 6 ml, 12x75 mm. Tubos de 10 ml para el lavado previo de la muestra. Pipeta automática (100µL) y puntas. Micropipeta con puntas. Agitador Vortex. Cronómetro. Centrífuga. Pipetas Pasteur o sistema de vacío para decantar las muestras. Agua destilada. Control isotípico negativo. Solución lisante de eritrocitos. Tampón fosfato (PBS) con suero de albúmina bovina (BSA) al 0.5% y azida sódica (NaN 3) al 0,09%. Preparación La obtención de sangre se debe hacer en forma aséptica por punción venosa (8, 9) en un tubo estéril de recolección de sangre que contenga un anticoagulante apropiado (se recomienda el uso de EDTA). Almacenar las muestras sanguíneas entre 18-22ºC hasta su procesamiento. Se recomienda procesar las muestras de sangre dentro de las 24 horas siguientes a su extracción. No deben utilizarse muestras hemolizadas o con agregados celulares en suspensión. Después de la reconstitución de los viales se recomienda realizar un spin antes de ser usados para asegurar que todo el volumen desalojado quede en el fondo del vial. 1. Puesto que este procedimiento de marcaje de las muestras incluye el marcaje de Inmunoglogulinas (Ig) de la superficie de la membrana celular (Sm), las muestras a estudio deben lavarse 2 veces para eliminar las proteínas séricas solubles (pasos 1a-1i). Es importante seguir las recomendaciones de los volúmenes apropiados después de decantar los sobrenadantes. a. Pipetear 100µL de la muestra a estudio en un tubo de 10 ml. Para muestras pequeñas (por ejemplo líquido cerebro espinal, aspirados de humor vítreo, etc) centrifugar el volumen total 5 minutos a 540g, decantar el sobrenadante con una pipeta Pasteur o sistema de vacío. Pág. 2 de 5 Última revisión: 05/05/2016

3 b. Añadir 2 ml de PBS + 0,09% de NaN 3 + 0,5% de BSA. c. Mezclar bien. d. Centrifugar durante 5 minutos a 540g. e. Decantar el sobrenadante usando una pipeta Pasteur o sistema de vacío, pero manteniendo intacto el precipitado celular. f. Añadir 2 ml de PBS + 0,09% de NaN 3 + 0,5% de BSA al precipitado celular. g. Mezclar bien. h. Centrifugar durante 5 minutos a 540g. i. Decantar el sobrenadante usando una pipeta Pasteur o sistema de vacío, pero manteniendo intacto el precipitado celular. 2. Pipetear 100µL de esta muestra en cada tubo de citómetro a estudio y añadir 50µL del vial reconstituido que contiene la combinación de 9 anticuerpos premezclados. 3. Mezclar bien. 4. Incubar 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. 5. Añadir 2 ml de una solución lisante de eritrocitos con fijador. 6. Mezclar bien. 7. Incubar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. 8. Centrifugar durante 5 minutos a 540g. 9. Decantar el sobrenadante usando una pipeta Pasteur o sistema de vacío, pero manteniendo intacto el precipitado celular. Dejar un volumen residual aproximado de 50µL en cada tubo. 10. Lavar la muestra añadiendo 2 ml de PBS + 0,5% de BSA. 11. Mezclar bien. 12. Centrifugar durante 5 minutos a 540g. 13. Decantar el sobrenadante usando una pipeta Pasteur o sistema de vacío, pero manteniendo intacto el precipitado celular. Dejar un volumen residual aproximado de 50µL. 14. Resuspender el precipitado celular con 200µL de PBS + 0,5% de BSA (sin azida). 15. Adquirir directamente en el citómetro de flujo dentro de la primera hora de finalizar la preparación de la muestra. Si las muestras no se analizan inmediatamente después de la preparación, se deben almacenar en oscuridad a 4-8ºC. La adquisición de muestras marcadas con este kit requiere la selección de condiciones de compensación adecuadas. Los distintos fluorocromos utilizados en citometría emiten a distintas longitudes de onda pero tienen cierto solapamiento espectral que debe corregirse mediante compensación electrónica. Los niveles óptimos de compensación pueden establecerse con tubos separados marcados con anticuerpos conjugados con los fluorocromos a utilizar en el ensayo. Para este propósito se incluye en el kit un vial de CD45-APC-C750 y otro de CD3-PE-Cyanine7. Análisis por CF En el análisis de los ficheros marcados con Lymphoclonal 9 puede resultar complicado definir las ventanas y regiones de análisis de forma manual, puesto que coexisten distintas poblaciones celulares en la misma fluorescencia. Cytognos recomienda el uso del software de análisis Infinicyt TM, que es capaz de usar patrones de reconocimiento y grabar estrategias de análisis para aplicar en ficheros similares de distintas muestras, usando así los mismos criterios. Encontrará información completa sobre dicho software en la página web: Se recomienda seguir las siguientes indicaciones para el análisis de los ficheros marcados con Lymphoclonal 9: 1. Seleccionar la población de leucocitos en base a su característica expresión de CD45. Visualizar sólo esta población en la pantalla de análisis. 2. Seleccionar las células T (CD3+) como primera población a identificar. Lymphoclonal 9 incluye el anticuerpo CD3-PE-Cyanine7 como único marcador que emite en esa fluorescencia, por lo que la selección de células T es fácil de identificar. 3. Sobre la población de células T, seleccionar e identificar las subpoblaciones de células T usando los otros marcadores de célula T incluidos en la mezcla (CD8-FITC y CD4-PerCP-Cyanine5.5). 4. Una vez que las células T se han clasificado, es recomendable no visualizar esas poblaciones en la pantalla de análisis y continuar con el análisis de las células B. 5. La población de células B puede entonces identificarse fácilmente en base a su expresión positiva de los marcadores CD20 y CD19, puesto que los otros marcadores que emiten en la misma fluorescencia son propios de células T y éstas no se muestran ahora en los diagramas. 6. Sobre la población de células B, seleccionar e identificar las subpoblaciones de células B usando los otros marcadores de célula B incluidos en la mezcla de anticuerpos (smigλ-fitc y smigκ-pe). 7. Una vez que las células B y T han sido clasificadas, se recomienda no visualizar esas poblaciones en la pantalla de análisis y continuar con el análisis de las células NK. 8. Las células NK pueden entonces identificarse fácilmente en base a su expresión CD56 positiva, puesto que las células que expresan el antígeno smigκ no se muestran en el diagrama ya que se han identificado antes como subpoblación de células B. RESULTADOS El recuento de las subpoblaciones linfocitarias generalmente se expresa como porcentaje de células marcadas respecto al total de linfocitos o leucocitos presentes en la muestra. LIMITACIONES Las muestras de sangre deben almacenarse a 18-22ºC y procesarse dentro de las 24 horas siguientes a su recolección. Es recomendable adquirir en el citómetro las muestras marcadas lo antes posible para optimizar los resultados, en caso contrario podrían marcarse de forma inespecífica células no viables. La exposición prolongada a reactivos líticos puede producir la degradación de los leucocitos y la pérdida de células de la población de interés. La presencia de glóbulos rojos nucleados y concentraciones anormales de proteína o hemoglobinopatías pueden dar lugar a la lisis incompleta de eritrocitos. Estas condiciones pueden dar lugar a recuentos celulares falsamente bajos puesto que los eritrocitos no lisados pueden ser contados como linfocitos. Los resultados obtenidos por CF pueden ser erróneos si el láser del citómetro no está perfectamente alineado o las ventanas de análisis están colocadas de forma incorrecta. Cada laboratorio debe establecer su propio rango de normalidad de las subpoblaciones linfocitarias en base las condiciones utilizadas. Se recomienda seguir los paneles de anticuerpos definidos por EuroFlow (1) junto con los procedimientos operativos de calidad para el ajuste del citómetro y la preparación y análisis de la muestra a estudio (6). Pág. 3 de 5 Última revisión: 05/05/2016

4 Las muestras de algunos pacientes pueden resultar difíciles de analizar si existen alteraciones o números muy bajos de la población celular a estudio. Las muestras celulares resultantes de la separación por gradiente de densidad pueden no tener la misma concentración relativa que la muestra de origen. Las diferencias pueden ser relativamente insignificantes en muestras de individuos con recuentos sanguíneos normales. En pacientes leucopénicos, la pérdida selectiva de subpoblaciones específicas pueden afectar a la exactitud de la determinación. Es importante comprender el patrón normal de expresión de los marcadores incluidos en el kit y su relación con la expresión de otros antígenos relevantes con el fin de realizar un análisis adecuado (1-5, 10, 11). Los estados patológicos no siempre se detectan por porcentajes anormales de ciertas poblaciones de leucocitos. Un individuo con una patología puede presentar los mismos porcentajes de leucocitos que un individuo sano. Por esta razón, es recomendable utilizar los resultados del ensayo en combinación con otros datos clínicos y de diagnóstico. CONTROL DE CALIDAD Para obtener resultados óptimos se recomienda verificar la precisión de las pipetas y que el citómetro está correctamente calibrado. BIBLIOGRAFÍA 1. van Dongen JJM, Lhermitte L, Böttcher S, Almeida J, van der Velden VHJ, Flores-Montero J, et al. EuroFlow antibody panels for standardized n-dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia 26(9): (2012). 2. Sanchez ML, Almeida J, Vidriales B, López-Berges MC, et al. Incidence of phenotipic aberrations in a serie of 467 patients with B chronic lymphoprolipherative disorders: basis for the design of specific four color stainnings to be used for minimal residual disease investigation. Leukemia 16/8: (2002). 3. Davis BH, Holden JT, Bene MC, Borowitz MJ, Braylan RC, Cornfield D, Gorczyca W, Lee R, Maiese R, Orfao A, Wells D, Wood BL, Stetler-Stevenson M Bethesda. International Consensus recommendations on the flow cytometric immunophenotypic analysis of hematolymphoid neoplasia: Medical indications. Cytometry Part B 72B:S5 S13 (2007). 4. Ruiz-Argüelles A, Rivadeneyra-Espinoza L, Duque RE, Orfao A, Latin American Consensus Conference. Report on the second Latin American consensus conference for flow cytometric immunophenotyping of hematological malignancies. Cytometry Part B 70B:39 44 (2006). 5. Stetler-Stevenson M. H43-A2 Clinical Flow Cytometric Analysis of Neoplastic Hematolymphoid Cells; Approved Guideline, 2nd ed. Clinical and Laboratory Standards Institute: Wayne, PA (2007). 6. Kalina T, Flores-Montero J, van der Velden VHJ, Martin-Ayuso M, Böttcher S, Ritgen M, et al. EuroFlow standardization of flow cytometry instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia 26: (2012). 7. Protection of Laboratory Workers from occupationally acquired infections. Second edition; approved guideline (2001). Villanova PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards; Document M29-A2. 8. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture- approved standard; Fifth edition (2003). Wayne PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards; Document H3-A5. 9. Clinical applications of flow cytometry: Quality assurance and immunophenotyping of lymphocytes; approved guideline (1998). Wayne PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards; Document H42-A. 10. Fukushima PI, Thi Nguyen PK, O`Grady P, Stetler-Stevenson M. Flow cytometric analysis of kappa and lambda light chain expression in evaluation of specimens for B-cell neoplasia. Cytometry (Communications in clinical Cytometry) 26: (1996). 11. Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate hematolymphoid neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 46: 23-7 (2001) GARANTÍA Este producto está garantizado sólo en cuanto a su conformidad con la cantidad y el contenido indicados en la etiqueta. No hay otras garantías más allá de lo indicado en la etiqueta del producto. La única responsabilidad de Cytognos se limita a la sustitución del producto o el reembolso del precio de compra. EXPLICACIÓN DE LOS SÍMBOLOS Fecha de caducidad (generalmente AAAA-MM) Límite de temperatura (ºC) Consulte las instrucciones de uso RUO LOT REF Para uso en investigación Código de lote Código de catálogo Mantener alejado de la luz Precaución: Azida sódica incluida Fabricante Pág. 4 de 5 Última revisión: 05/05/2016

5 FABRICADO POR CYTOGNOS SL Polígono La Serna, Nave Santa Marta de Tormes Salamanca (España) Tel: Fax: Información sobre pedidos: admin@cytognos.com Información técnica: support@cytognos.com Pág. 5 de 5 Última revisión: 05/05/2016