Protocolo de iniciación PCR. a tiempo real

Transcripción

1 Protocolo de iniciación PCR a tiempo real

2 CERTEST Biotec, S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, Calle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPAIN)

3 Protocolo de iniciación PCR a tiempo real Objetivo El objetivo de este protocolo es facilitar la formación de personal técnico de laboratorio en la realización de pruebas diagnósticas moleculares basadas en la técnica PCR a tiempo real o qpcr a partir de muestras fecales. El uso de los test RNA-DNA Viasure Extraction Kit y Viasure Pathogen Real Time PCR Detection Kit, en combinación con los signos y síntomas presentados por los pacientes, permitirá al personal sanitario especializado establecer un diagnóstico clínico. Para una información más detallada puede consultarse las instrucciones de cada kit: RNA-DNA Viasure Extraction Kit y Viasure Pathogen Real Time PCR Detection Kit. Para desarrollar de manera correcta las actividades mencionadas es necesario adaptar las instalaciones con el equipamiento adecuado y establecer áreas diferenciadas donde se realizarán cada una de las diferentes etapas del proceso. Es recomendable mantener un flujo de trabajo unidireccional. La unidad de diagnóstico molecular se compone de 4 zonas: Área Extracción Ácidos Nucleicos Área Pre - PCR Área Set- up PCR Área amplificación e interpretación de resultados Procesamiento de muestras. Extracción de DNA/RNA con kit comercial manual o sistema automático (Opcional). Reconstituir el número de pocillos necesarios. Añadir control negativo. Reconstituir control positivo liofilizado. Añadir DNA/RNA extraído de cada muestra. Añadir control positivo. Sellar los pocillos con tapones ópticos. Colocar las tiras en el equipo de PCR a tiempo real. Programar termociclador e iniciar el protocolo Análisis de resultados con sofware propio del equipo. Recomendaciones Es importante destacar que la PCR a tiempo real o qpcr es una herramienta de diagnóstico molecular altamente sensible y específica por lo que es estrictamente necesario mantener unas normas de higiene, orden y seguridad, con el fin de evitar posibles contaminaciones que podrían afectar gravemente al desarrollo de la prueba. El personal del Laboratorio de Biología Molecular debe contar con una indumentaria exclusiva en cada una de las zonas de trabajo. Es recomendable la desinfección al inicio del proceso y tras el uso de los equipos. Soluciones desinfectantes comerciales. Etanol 70%.

4 1Área Extracción Ácidos Nucléicos A B Esta primera área tiene como objetivo el procesamiento de muestras potencialmente infecciosas y su posterior extracción y purificación de ácidos nucleicos con el kit RNA-DNA Viasure Extraction Kit. Por ello se establece como zona de riesgo biológico y se recomienda situar todos los equipos en cercanía para minimizar los desplazamientos. El equipamiento requerido para esta área se divide en dos grupos: Equipamiento básico: Campana de bioseguridad Material EPI: Guantes desechables (sin polvo), bata, mascarilla, gorro. Micropipetas ( µl y µl) (Uso exclusivo para zona de riesgo biológico). Puntas con filtro. Gradillas tubos 1,5 2,0 ml (Uso exclusivo para zona de riesgo biológico). Equipamiento asociado al kit de extracción: Vórtex. Microcentrífuga viales 2 ml (> rpm). Termobloque. En esta área utilizaremos el RNA-DNA Viasure Extraction Kit. El orden de ejecución y los componentes que usaremos se detallan en el cuadro adjunto. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS FECALES Homogeneizar la muestra fecal y transferir 100 µl / 100 mg en un vial de 2 ml con 200 µl de agua libre de RNAsa/DNAsa, PBS o suero fisiológico. Vortear la muestra 30 s y centrifugar 1 min a x g ( rpm). PROTOCOLO Viasure RNA/DNA Extraction Kit PASO 1. LISADO DE MUESTRAS Transferir 200 µl del sobrenadante al tubo 2.0 ml Collection-Tube (Evitar la aspiración de partículas en suspensión). Añadir 200 µl de Lysis Buffer y 20 µl de Proteinase K, vortear vigorosamente. Incubar 10 min a 65 C y posteriormente 10 min a 95ºC. PASO 2. UNIÓN DNA/RNA A LA COLUMNA Añadir 260 µl de Binding Buffer y mezclar por pipeteo o vórtex. Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 5 min. Transferir el lisado a la columna Mini Spin Column Set. Centrifugar 1 min a x g ( rpm). Descartar el filtrado y el RTA Collection Tube. Colocar la columna Mini Spin Column en un nuevo RTA Collection Tube. PASO 3 y 4. PRIMER Y SEGUNDO LAVADO Añadir 600 µl de Wash Buffer I. Centrifugar 1 min a x g ( rpm). Descartar el filtrado y el RTA Collection Tube. Colocar la columna Mini Spin Column en un nuevo RTA Collection Tube. Añadir 700 µl de Wash Buffer II. Centrifugar 1 min a x g ( rpm). Descartar el filtrado y colocar la columna Mini Spin Column en el mismo RTA Collection Tube. Repetir el paso de lavado con 700 µl de Wash Buffer II. Centrifugar 1 min a x g ( rpm). Descartar el filtrado y colocar la columna Mini Spin Column en el mismo RTA Collection Tube. PASO 5. ELIMINACIÓN DE RESIDUOS DE ETANOL Centrifugar 5 min a x g ( rpm) para eliminar el etanol residual. Descartar el filtrado y el RTA Collection Tube. PASO 6. ELUCIÓN DE DNA/RNA Colocar la columna Mini Spin Column en el tubo estéril 1,5 ml Collection Tube. Añadir 100 µl de Elution Buffer (previamente precalentado a 65 C). Incubar 1 min a temperatura ambiente. Centrifugar 1 min a x g ( rpm). Descartar la columna Mini Spin Column. Cerrar el 1.5 ml Collection Tube y almacenar la muestra de DNA/RNA a 4 C para un uso inmediato o preservar de -20 C a -80 C para períodos mas prolongados.

5 2Área Pre-PCR El área de pre-pcr se recomienda mantener libre de cualquier tipo de material biológico, para evitar así posibles contaminaciones que interfieran en los resultados del test. El equipamiento requerido para esta área es el siguiente: Separar el número de reacciones/pocillos necesarios (incluyendo las muestras y los dos pocillos reservados para el control positivo y negativo que deben ser siempre incluidos en cada ensayo). En caso necesario, recortar con unas tijeras el número de pocillos requeridos. Retirar el aluminio protector. Equipamiento básico: Campana de flujo laminar. Material EPI: Guantes desechables (sin polvo), bata, mascarilla, gorro. Micropipeta (2 20 µl) (Uso exclusivo para la rehidratación de los pocillos y la adición del control negativo). Puntas con filtro. Tijeras. Gradillas tubos 0,1 0,2 ml. Reconstituir cada uno de los pocillos con 15 µl del tampón de rehidratación (vial azul). Añadir 5 µl del control negativo (vial morado) en el pocillo reservado para control negativo. En esta área utilizaremos el test Viasure Pathogen Real Time PCR Detection Kit. El orden de ejecución y los componentes que usaremos se detallan en el cuadro adjunto. Tras este proceso trasladaremos los pocillos rehidratados al área Set-up PCR.

6 3Área Set-up PCR A B El área Set-Up PCR es la zona donde se realizan dos procesos independientes: Rehidratación del control positivo. Adición a los pocillos rehidratados de los ácidos nucleicos y el control positivo. El riesgo biológico no es potencialmente infeccioso para el personal del laboratorio, pero se aconseja mantener esta zona correctamente limpia y desinfectada para evitar contaminaciones que comprometan el resultado del test. Aunque es recomendable mantener zonas diferenciadas (Extracción de ácidos nucleicos, pre-pcr y Set- Up PCR), esta área podría ser compartida con el área pre-pcr (área 2) manteniendo la precaución de limpiar correctamente la campana entre ambos procesos y diferenciar el uso de pipetas (1ª Pipeta 2 20 µl: Uso para el tampón de rehidratación y control negativo, 2ª Pipeta 2 20 µl: Uso para ácidos nucleicos y control positivo). A- REHIDRATACIÓN DEL CONTROL POSITIVO El test Viasure Pathogen Real Time PCR Detection Kit suministra un control positivo que es necesario rehidratar para su posterior uso en cada ensayo. Debido a que contiene una gran cantidad de copias molde del patógeno, se recomienda abrirlo y manipularlo antes de comenzar el ensayo. Posteriormente, limpiar la zona con soluciones desinfectantes comerciales y/o etanol 70%. No olvidar desechar los guantes empleados al finalizar esta tarea. Reconstituir el control positivo (vial rojo) con 100 µl de agua libre de RNAsa/ DNAsa (vial blanco) y mezclar con la ayuda del vórtex. Almacenar a -20ºC tras su resuspensión. Separar en alícuotas para minimizar los ciclos de congelación y descongelación. B- Adición a los pocillos rehidratados de los ácidos nucleicos y el control positivo Añadir 5 µl del DNA/RNA extraído de cada muestra en los pocillos rehidratados (a excepción de los dos pocillos reservados para añadir el control negativo y positivo). Equipamiento básico: Campana de flujo laminar. Material EPI: Guantes desechables (sin polvo), bata, mascarilla, gorro. Micropipeta (2 20 µl) (Uso exclusivo para la adición de los ácidos nucleicos y el control positivo). Puntas con filtro. Tijeras. Gradillas tubos 0,1 0,2 ml. Añadir 5 µl del control positivo reconstituido (vial rojo) en el pocillo reservado para control positivo. Separar el número de tapones ópticos necesarios y cerrar los pocillos. En caso necesario, recortar con unas tijeras el número de tapones ópticos requeridos con la precaución de no tocar la parte interna con los guantes. En esta área utilizaremos el test Viasure Pathogen Real Time PCR Detection Kit. El orden de ejecución y los componentes que usaremos se detallan en el cuadro adjunto. Tras este proceso trasladaremos nuestra placa/tira, ya cerrada, al equipo de PCR a tiempo real.

7 4Área Amplificación e Interpretación de Resultados El área de amplificación e interpretación de resultados es la zona donde se encuentran ubicados el equipo y sus componentes asociados. Se recomienda situarlo en cercanía al área Set-Up para minimizar los desplazamientos. Colocar la tira/placa en el termociclador. Se recomienda colocar el mismo número de tiras/pocillos a ambos lados del bloque del termociclador con el fin de compensar el equipo. Programar el termociclador e iniciar el protocolo. Equipamiento básico: Equipo PCR en tiempo real. Ordenador. En esta área utilizaremos el test Viasure Pathogen Real Time PCR Detection Kit. El orden de ejecución y los componentes que usaremos en esta área se detallan en el cuadro adjunto. PROTOCOLO TÉRMICO DNA Nº Ciclos Tiempo Temperatura 1 2 min 95ºC s 95ºC 50 s 60ºC* * Recolección de datos PROTOCOLO TÉRMICO RNA Nº Ciclos Tiempo Temperatura 1 15 min 45ºC 1 2 min 95ºC s 95ºC 50 s 60ºC* Análisis de los resultados con el software propio del equipo Patógeno Control interno Control negativo Control positivo Interpretación + +/- * - + Patógeno Positivo Patógeno Negativo Inválido Inválido * La detección del control interno no es necesaria en caso de muestras altamente positivas. Un elevado número de copias del patógeno presentes en la muestra puede conducir a una señal débil o ausente en el control interno.

8 CERTEST Biotec, S.L. Pol. Industrial Río Gállego II, Calle J, Nº 1, 50840, San Mateo de Gállego, Zaragoza (SPAIN) Real Time PCR Detection Kits Version: SP 1507