Introducción. Título. Profesor Guía. Unidades Ejecutoras. Helicobacter pylori

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1 Departamento de Microbiología Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción Título Citometría de flujo en la evaluación de potencial de membrana y viabilidad celular de Helicobacter pylori CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA EVALUACIÓN DE POTENCIAL DE MEMBRANA Y VIABILIDAD CELULAR DE Helicobacter pylori Profesor Guía Dra. Apolinaria García Cancino Unidades Ejecutoras T.M. Juan Luis Castillo Navarrete Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción. Laboratorio de Citometría de Flujo, Hospital del Trabajador Concepción. Helicobacter pylori Patógeno gastroduodenal humano ph óptimo Hábitat Mucosa gástrica Introducción (neutrófila) Agente etiológico: Ureasa Enfermedad péptica ulcerosa Dispepsia no ulcerosa Gastritis crónica superficial Linfoma MALT Cáncer Crecimiento a ph < 4.5 Gastroenterology 1992: 102;

2 Bacterias aeróbicas Gradiente electroquímico de protones (membrana) Potencial de membrana Egreso de protones Ingreso de electrones Fuerza protón motriz Disminución Aumento Ingreso / Egreso de solutos Gradiente eléctrico Depolarización -100 a -200 mv Interior negativo Potencial de membrana J Microbiol Methods. 2004:59; Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Adv Drug Deliv Rev. 2005:57; Ionóforos Se reduce a cero Hiperpolarización J Microbiol Methods. 2004:59; Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Adv Drug Deliv Rev. 2005:57; Potencial de membrana ( Ψ Ψ) Eucariontes Microelectrodos Compuestos para ensayos Potenciométricos Carbocianinas (slow response probes) Procariontes Cationes lipofílicos radiomarcados DiOC 2 (3) (488 nm) Fluorescencia verde: Se altera con el tamaño celular Es independiente del Ψ Fluorescencia roja: Dependiente del tamaño y del Ψ Se altera con agregados Citometría de Flujo Valor promedio de suspensión celular completa Razón F. roja / F. verde: Medida de Ψ Independiente del tamaño Bacterias en crecimiento activo J Microbiol Methods. 2004:59; Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Adv Drug Deliv Rev. 2005:57; DiOC 2 (3): (3,3 -dietiloxacarbocianina iodada) Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43; Handbook of fluorescent probes, (

3 Impermeabilidad membrana celular Sustancias fluorescentes / vitales Indicador de viabilidad celular Permeabilidad membrana celular Indicador de muerte celular Compuestos orgánicos con al menos 2 cargas (+) Compuestos fluorescentes que se unen a ácidos nucleicos Excluidos por membranas celulares intactas (eucariontes y procariontes) Adv Drug Deliv Rev. 2005:57; Letter Appl Microbiol 2002:34;1-7 FEMS Microbiol Rev 2000:24; Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43; Propidium iodado (PI) TO-PRO-3 TO-PRO-1 Sytox Green Bromuro de etidio (BrEt) Viabilidad celular Letter Appl Microbiol 2002:34;1-7 FEMS Microbiol Rev 2000:24; Adv Drug Deliv Rev. 2005:57; Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43; Membrana Celular Hipótesis Potencial de membrana Indicador de estado fisiológico de la membrana Impermeabilidad de la membrana a ciertas sustancias Viabilidad celular Letter Appl Microbiol 2002:34;1-7 FEMS Microbiol Rev 2000:24; Adv Drug Deliv Rev. 2005:57; Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43; Mediante citometría de flujo, es posible determinar los parámetros de tamaño, forma celular, potencial de membrana y viabilidad celular en células bacterianas. Los diversos agentes antibacterianos utilizados en el tratamiento de la infección por Helicobacter pylori, producen alteraciones en la células bacteriana, tanto de tamaño, morfología, como también en el potencial de membrana y viabilidad celular; parámetros determinables mediante citometría de flujo.

4 Estimación de bio volumen bacteriano Cytometry 2001:44; Appl Environ Microbiol 1998:64; Cytometry 2000:41;41-5 Objetivos Generales Ψ en Gram positivos y Gram negativos Ácidos nucleicos y viabilidad celular Efecto de antimicrobianos sobre bacterias. Análisis monoparamétrico de poblaciones celulares Cytometry 1999:35;55-63 Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Methods 2000:21; Cytometry 2001:43; Antimicrob Agents Chemother 2000:44; J Microbiol Methods 2000:42(1);1-2 Letters Appl Microbiol 2002:34;1-7 Cytometry 1997:29; Cytometry 1994:17; Cytometry 1994:17;302-9 Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Antimicrob Agents Chemother 1998:42; FEMS Microbiol Rev 2000:24; Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Cytometry Part A 2003:53A; Cytometry 1998:32; Cytometry 2001:43;55-68 Determinar por citometría de flujo, los parámetros de tamaño, forma, viabilidad celular y potencial de membrana en células bacterianas. Determinar el efecto que ejercen sobre el potencial de membrana y la viabilidad celular de Helicobacter pylori, diversas sustancias que tienen acción contra esta bacteria. Objetivos específicos Determinar, mediante citometría de flujo, los parámetros de tamaño, forma, viabilidad celular y potencial de membrana, en Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Determinar, mediante citometría de flujo, los parámetros de tamaño, forma, viabilidad celular y potencial de membrana, en Helicobacter pylori. Metodología Evaluar el efecto de agentes antibacterianos usados comúnmente en el tratamiento de erradicación de Helicobacter pylori, sobre el potencial de membrana y viabilidad celular de Helicobacter pylori.

5 Cepas bacterianas Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus ATCC Helicobacter pylori ATCC Viabilidad celular Potencial de membrana Eflujo a BrEt Cultivo líquido (18 horas, 37 C) en caldo Müeller Hinton filtrado (0.20 µm) Escherichia coli K12 Pseudomona aeruginosa Acinetobacter baumannii. Bacillus subtilis Helicobacter pylori 636-C, 594-C, 612-C, 632-C633-A Estimación de patrones de forma celular en función del tamaño Bacterias vivas Bacterias muertas Protocolo básico de trabajo Cultivo líquido (18 horas, 37 C) Protocolos de marcación Tubo 1 2 Células vivas (µl) Células muertas (µl) µl células vivas y/o muertas Incorporación de PI 10 µl PI 1 mg/ml Incubación y adquisición (10 µg/ml, concentración final) µl células vivas y/o muertas Estimación de Ψ 30 µl DiOC2(3) 1 mm (30 µm, concentración final) Incubación y adquisición

6 Metodología Citometría de Flujo Equipo FACSCalibur, B.D. Láser de Argón, 488 nm. Adquisición Análisis Software CellQuest v3.3 Máximo de 1000 eventos/seg eventos celulares Software CellQuest v.3.3 Media de intensidad de fluorescencia verde y roja. Cálculo razón F. roja / F. verde Software Flow Explorer Rev Méd Chile 1999:127; Antimicrob Agents Chemother 2000:44; Cytometry 1999:35;55-63 / 2001:43; Resultados Definición de gate de análisis Resultados Estimación patrones de forma celular en función del tamaño

7 Estimación de patrones de forma celular en función del tamaño Estimación de patrones de forma celular en función del tamaño Markers (+/- channels) M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 P. aeruginosa E. coli A. baumannii B. subtilis Estimación de patrones de forma celular en función del tamaño, en cepas de Helicobacter pylori Resultados Incorporación de PI en Staphylococcus aureus y Escherichia coli

8 Incorporación de PI E. coli: Incorporación E.coli : de PI de por PI por células muertas (shock frío). (Shock frío). Ensayo Ensayo en por triplicado. Células vivas Células muertas Células vivas y muertas (1:1) 0.98% 51.37% 99.03% Porcentaje Células muertas x 10 6 S. aureus : Incorporación de PI por células S. aureus: Incorporación de PI por células muertas (shock frío). (Shock frío). Ensayo por triplicado. Ensayo en triplicado. Porcentaje 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0,000 3,000 6,000 9,000 12,000 15, ,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 0,000 3,000 6,000 9,000 12,000 15,000 Células muertas x 10 4 R = R = Estimación de Ψ Resultados dep. dep. S. aureus PM.005 S. aureus pm.005 Ψ en Staphylococcus aureus y Escherichia coli pol. Flow Explorer pol. Células vivas y muertas (1:1) Razón FL2/FL1

9 S. aureus: Células polarizadas y depolarizadas. Razón flourescencia roja / verde (DioC2(3)). Ensayo por triplicado. R = (pol) 100,00 90,00 Porcentaje 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 R = (dep) Resultados R = (pol) 0,00 100,00 90,00 80,00 70,00 0,000 3,000 6,000 9,000 12,000 15,000 Células muertas x 10 4 E. coli: Células polarizadas y depolarizadas. Razón flourescencia roja / verde (DioC2(3)). Ensayo por triplicado. Incorporación de PI y Ψ en Helicobacter pylori Porcentaje 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 R = (dep) 0,00 0,000 3,000 6,000 9,000 12,000 15,000 Células muertas x 10 6 H. pylori: Incorporación de PI H. pylori: Incorporación de DioC2(3)

10 Eflujo a Bromuro de Etidio Resultados Ingreso por difusión pasiva Intercalante monocatiónico Eflujo a bromuro de etidio en Staphylococcus aureus y Escherichia coli Sistema de eflujo del tipo MFS (Major facilitator superfamiliy), dependiente de la fuerza protón motriz (Fluoroquinolonas hidrofílicas, compuestos orgánicos monocatiónicos: Acriflavina, BrEt, Bromuro de tetrafenilfosfonio) 15 µl células vivas y/o muertas 20 µl BrEt 1 mg/ml Incubación y adquisición (20 µg/ml, concentración final) Cytometry 1994:17; Eflujo a Bromuro de Etidio Incorporación de PI y eflujo a bromuro de etidio 1.29 % % E. coli S. aureus R=0.999 R=0.999 R=0.999 R=0.998 Células vivas Células muertas

11 H. pylori: Eflujo a bromuro de etidio Resultados Eflujo a bromuro de etidio en Helicobacter pylori H. pylori: Incorporación de PI H. pylori: Eflujo a BrEt H. pylori: Incorporación de DioC 2 (3) Conclusiones CCCP: Carbonyl cyanide m-chlorophenyl-hydrazone MC 207,110: phe arg-b-naphthylamide

12 Conclusiones Conclusiones 1 Desarrollo de un método de análisis de estimación de patrones de forma celular en función del tamaño de células bacterianas. 3 Definición de viabilidad celular considerando en conjunto, la incorporación de yoduro de propidio, Ψ y eflujo a bromuro de etidio. 2 Evaluación por citometría de flujo de: incorporación de yoduro de propidio Ψ (DIOC 2 (3)) eflujo a bromuro de etidio. 4 En Helicobacter pylori, bajo las condiciones experimentales ensayadas no fue factible evaluar incorporación de yoduro de propidio, Ψ y eflujo a bromuro de etidio. Proyecciones Desarrollo de método de estimación de patrones de forma celular en función del tamaño Proyecciones 1. Ventajas: Método sencillo y rápido Uso de parámetros intrínsecos a la células Aplicaciones 2. Limitaciones: Necesidad de células en suspensión Mezcla de poblaciones celulares dificulta la discriminación

13 Proyecciones Proyecciones Patrones de forma celular en función del tamaño Incorporación de PI Estudio de acción de diversas sustancias sobre bacterias Viabilidad v/s cultivabilidad Estudio de la presencia y actividad de sistemas de eflujo en bacterias, desde un punto de vista fisiológico y funcional. Estimación de Ψ Eflujo a BrEt Búsqueda de otras condiciones metodológicas en H. pylori Estudio de sistemas de eflujo y resistencia a drogas en células neoplásicas (fenotipo MDR) Agradecimientos Lab. Patogenicidad Bacteriana, Dpto. Microbiología A.M. y F. S.. F.D. Different people see microorganisms from different perspectives Laboratorio de Citometría de Flujo, Hospital del Trabajador Concepción U. De Talca Profesor guía Comisión evaluadora Profesores Compañeros Personal del Dpto. Amigos Howard M. Shapiro Mis padres y hermano Carmen Gloria Mis hijos

14 Departamento de Microbiología Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción CITOMETRÍA DE FLUJO EN LA EVALUACIÓN DE POTENCIAL DE MEMBRANA Y VIABILIDAD CELULAR DE Helicobacter pylori T.M. Juan Luis Castillo Navarrete