GENOTIPIFICACION DE Helicobacter pylori MEDIANTE PCR DIRECTO DEL TEST DE UREASA

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Eva Peralta Bustamante
hace 7 años
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1 GENOTIPIFICACION DE Helicobacter pylori MEDIANTE PCR DIRECTO DEL TEST DE UREASA

2 INTRODUCCION Evolución de la infección por H. pylori Curación espontánea Persistencia sin complic. Infección por H. pylori Gastritis antral superficial Gastritis crónica atrófica Cáncer gástrico Crabtree, 1993; Nomura, 1991; Parsonnet, 1991 Ulcera duodenal NIH Concensus, 1994 Hiperprolif. linfoide Ulcera gástrica NIH Concensus, 1994 Modificado de Gomollón F. Medicine 1996; 7(3): Linfoma MALT Parsonnet, 1994; Wotherspoon,1993

3 INTRODUCCION Prevalencia de la infección por H. pylori 30% 30% 40% 50% 70% 60% 90% 90% 70% 80% 70% 70% 70% 70% 20% Martínez et al, Gastr Latinoam 1999, 10(4): 316 Congreso: Basic Mechanisms to Clinical Cure, Bermuda 2000

4 Infección por H. pylori Colonización flagelo molc. adhesión ureasa Acción sobre epitelio LPS o endotoxina citotoxina o VacA CagA hsp Epitelio gástrico PMN Respuesta inmune IL-8 TNFalfa proteína C reactiva

5 Atherton, 1998 INTRODUCCION Factores de virulencia: CagA y VacA vaca caga s1a caga+ > caga- s1b s m 89% m1 > m2 s2 20% ENFERMEDAD PEPTICA ULCEROSA DAÑO EPITELIO GASTRICO MAYOR RIESGO DE INDUCIR ENF. PEPTICA ULCEROSA (EPU) vaca caga+ s1 m1

6 INTRODUCCION Prevalencia genotipo vaca s1a-s1b/m1 s1b/m1 s1a-s1b/m1 s1b/m1 s1a/m1 s1a/m1 s2/m2 s1a/m1 s1b/m1 Martínez et al, Rev Med Chile 2001, 129: th International Workshop on Pathogenesis and Host Response in Helicobacter Infections. Denmark, 2000

7 HIPOTESIS BIOPSIA PARA TEST DE UREASA GENOTIPIFICACION MEDIANTE PCR FACTORES DE VIRULENCIA RESISTENCIA ANTIBIOTICA

8 OBJETIVO Determinar la factibilidad de realizar PCR directo de las biopsias tomadas para test de ureasa (HePy test) Estudio de características de las cepas de Helicobacter pylori factores de patogenicidad resistencia antibiótica presencia caga genotipo vaca

9 METODOLOGIA Y RESULTADOS

10 METODOLOGIA Toma de muestras ENDOSCOPIA DIGESTIVA ALTA BIOPSIA MUCOSA ANTRAL Y/O CUERPO ureasa + Histopatología Test de ureasa: He-Py test

11 METODOLOGIA Extracción ADN hervir por 10 min DNA en sobrenadante Chelex 100 Centrifugación rpm * 5 min Rudi et al, 1999

12 METODOLOGIA Amplificación por PCR 16S ARNr UHP1 ADN Helicobacter pylori: 16S ARNr UHP2 5 -CTA TGA CGG GTA TCC GGC ATT CCA CCT ACC TCT CCC A pb 16S ARNr ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Rudi et al, 1999

13 RESULTADOS Amplificación por PCR 16S ARNr Paciente Nº pb 1078 pb 872 pb 603 pb 376 pb 310 pb

14 Atherton et al., 1995; Tummuru et al, 1999 METODOLOGIA Amplificación por PCR: caga y vaca caga s vaca m Tummuru et al., 1993 Atherton et al., pb s1a: 187 pb s1b: 190 pb s2: 199 pb m1: 290 pb m2: 352 pb ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 3%

15 RESULTADOS Amplificación por PCR gen caga Paciente Nº pb 1078 pb 872 pb 603 pb 310 pb 349 pb

16 Atherton et al., 1995; Tummuru et al, 1999 METODOLOGIA Amplificación por PCR: caga y vaca caga s vaca m Tummuru et al., 1993 Atherton et al., pb s1a: 187 pb s1b: 190 pb s2: 199 pb m1: 290 pb m2: 352 pb ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 3%

17 RESULTADOS Amplificación gen vaca secuencia señal Paciente Nº pb 1078 pb 872 pb 603 pb 310 pb 199 pb 187 pb

18 RESULTADOS Amplificación gen vaca región media pb 1078 pb 872 pb 603 pb 310 pb 352 pb 290 pb Paciente Nº

19 Genotipos detectados ACHS Pte. Diagnóstico caga vaca s 1 DNU (+) s2 m2 2 DNU (+) s1a m1 3 DNU (-) s1a m1 4 DNU (-) s1a m1 5 EPU (-) s1a-s2 m2 6 EPU (+) s1a m1 7 DNU (+) s1a-s1b m1 8 DNU (-) s1a-s2 m2 9 DNU (-) s1a-s2 m2 10 DNU (-) s2 m2 m

20 Genotipos detectados San Borja Pte. Diagnóstico caga vaca s 1 DNU (-) s2 m1 2 DNU (-) s1b-s2 m1 3 DNU NT NT NT 4 DNU (-) s1a-s2 m2 5 EPU (-) s1b-s2 m2 6 DNU (-) s1a m1 7 EPU (-) s2 m1-m2 8 DNU (+) s2 m2 9 EPU (-) s1a m1 10 DNU (-) s1b-s2 m1-m2 NT = no tipificada m

21 CONCLUSIONES El uso de la técnica de PCR permite determinar diversas características de las cepas que infectan a nuestros pacientes. Es factible utilizar las biopsias tomadas para test de ureasa en estudios de PCR. Esto evita incrementar el número de biopsias tomadas al paciente. Eventualmente sería factible determinar la resistencia antibiótica a claritromicina, complementando el cultivo y antibiograma.

22 GRUPO DE INVESTIGACION Dr. Fernando Kawaguchi, MD, PhD (2,3) Dra. Alejandra Martínez, MD MsSc Prof. Jorge Roa Sandoval, PhD (1) Dr. Mauricio González MD (4) Prof. Rolando Montoya PhD (1) Dr. Jaime Madariaga Boero MD (1) Dr Carlos Gonzalez PhD (1) Dra. Apolinaria García PhD (1) Sr Marcelo Castillo MsSc (1,2,3) Sr Juan Luis Castillo MsSc (1,3) Dr Fdo Riquelme MD (2,3) Dr Rodrigo Loayza MD, PhD (3) Dra CG Yañez MD (3) Sra. Edith Vega, EU (3) ALUMNOS AYUDANTES Ignacio Alfaro Pérez (1) Cristian Palma Valdés (1) Rodrigo Baier Chandía (1) Nelson Perez Lynch, (1) (1) FACULTAD DE CS. BIOLOGICAS (2) FACULTAD DE MEDICINA (3) HOSPITAL ACHS (4) HOSP. SAN BORJA ARRIARAN

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