Javier Pemán Unidad de Micología Servicio de Microbiología Hospital Universitario La Fe Valencia

Transcripción

1 Técnicas de sensibilidad in vitro a los antifúngicos Javier Pemán Unidad de Micología Servicio de Microbiología Hospital Universitario La Fe Valencia Palma de Mallorca, 11 febrero 2010

2 Detección de resistencias in vitro Son un problema real? La teoría (técnicas estandarizadas) La práctica (técnicas para la vida diaria)

3 Fracaso de la terapia antifúngica Hongo: Resistencia AF Célula fúngica Tamaño población Huésped: Estado inmune Persistencia del foco: Cuerpos extraños Abscesos Lugar de la infección Incumplimiento tto. Antifúngico: Dosis Farmacocinética Actividad Interacciones

4 Puntos de corte CMI (µg/ml) Sensible SDD / I Resistente Fluconazol Itraconazol 0,125 0,25-0,5 1 5-FC Voriconazol Caspofungina 2 >2* Anidulafungina 2 >2* Micafungina 2 >2* Oficial * No sensible CLSI M27-S3, 2008 (Candida spp.) Anfotericina B 1 2 Oficioso

5 Patrón habitual de sensibilidad Levaduras AMB 5-FC FZ ITR VOR CAS C alb S S S S S S C tro S S S/ S/ S S C par S S S S S S-R C gla I S SDD-R SDD S S C kru I-R I-R R SDD-R S S C lus S R S SDD S S

6 Patrón habitual de sensibilidad Hongos filamentosos AMB ITR VOR POS CAS A fum S S S S S A terr R S S S S F sol R R S S R S api R R S S S S pro R R R R R Zygom S R R S R

7 Predicción respuesta clínica CMI Otros factores: Inmunidad Estado general Localización infección Cuerpos extraños CMI : fracaso terapéutico CMI : no éxito terapéutico

8 Estudio Sensibilidad AF Métodos estandarizados CLSI: Levaduras: Dilución: M27-A3 (2008) Difusión: M44-A2 (2009) Filamentosos: Dilución: M38-A2 (2008) Difusión: M51-P (2009) Dermatofitos: M38-A2 (2008) EUCAST: Levaduras: Edef 7.1 (2008) Filamentosos: Edef 9.1 (2008)

9 Estudio Sensibilidad AF Métodos comerciales disponibles Dilución: Sensititre YeastOne Fungitest Difusión agar: Etest Neo-Sensitab

10 Métodos estandarizados diferencias M27-A3 (CLSI) Microplacas Fondo en U Fondo plano Medio de cultivo RPMI1640 con glutamina sin CO 3 HNa y con 0,2% glucosa Tampón MOPS 0,164M; ph 7 0,1 EDef 7.1 (EUCAST) RPMI1640 con glutamina sin CO 3 HNa y con 2% glucosa Inóculo 0,5 a 2, UFC/mL 0,5 a 2, UFC/mL Incubación Candida spp: azoles y anfotericina B, h; candinas, 24h. C. neoformans: 72h Temperatura 35 ºC Candida spp.: 24 h Lectura Visual Espectrofotométrica Definición CMI Anfotericina B: concentración más baja que produce una inhibición total del crecimiento. Resto: concentración más baja que produce una inhibición del crecimiento 50% Cepas Control C. krusei ATCC 6258; C. parapsilosis ATCC 22019

11 CLSI, M27-A3 Problemas: Lectura de anfotericina B Solución: Utilizar Etest o Calcular la CMF C. albicans ATCC

12 Medio: Mueller-Hinton Agar (2% glucosa) + 0,5% Azul Metileno Inóculo: 1 5 x 10 6 UFC/mL Incubación (35 ºC) : h M44-A2 Buena correlación con M27-A3 ATCC 22019

13 M44-A2 Solo estandarizado para CAS, FLZ y VOR: Puntos de corte (mm): FLC 25 También hay buena correlación con otros AF S S-DD R FLZ VOR CAS 11

14 M44-A2 FLC 25 Problemas : Sólo estandarizado para CAS, FLZ y VOR Lectura azoles C. krusei y C. glabrata CMI vs diámetro inhibición

15 M44-A2 FLC 25 C. krusei y C. glabrata : A las 24 h no detecta bien las resistencias Prolongar tiempo incubación (48h)

16 M44-A2 FLC 25 Lectura de los azoles: Presencia de colonias en el interior del halo Ignorar las microcolonias dentro del halo inhibición

17 Sensititre Yeast One Y09 Medio: RPMI (MOPS) + 1,5% glucosa, ph 7±0,1 Indicador colorimétrico (Alamar Blue) Inóculo: 1,5-8 x 10 3 UFC/mL Incubación (35 ºC) : 24 h Lectura: Cambio color (rosa azul) NO por turbidez Anfotericina B 5-fluorocitosina Fluconazol Itraconazol Posaconazol Voriconazol Anidulafungina Caspofungina Micafungina

18 Lectura Sensititre Yeast One Control growth.25 AMB-16 µg/ml 16 2 FLC-256 µg/ml ITR-16 µg/ml 1 KTC-16 µg/ml.06 5-FC-64 µg/ml CMI de anfotericina B: El pocillo azul con la concentración más baja de antifúngico CMI de azoles: El pocillo azul o púrpura con la concentración más baja de antifúngico

19 Sensititre Yeast One Problemas: Trailing Efecto paradójico

20 Sensititre Yeast One Presencia de trailing : Dificultad de apreciar el cambio de color en algunas cepas En azoles No prolongar la incubación (18-24 h) Incubar a 35ºC (muy importante con ITR)

21 Sensititre Yeast One Efecto paradójico: Crecimiento a concentraciones > CMI Más frecuente con ITR y candinas No valorar su aparición al informar la CMI

22 Problemas: Humedad de la placa Lectura azoles Lectura anfotericina B ETEST Levaduras Hongos filamentosos Medio: RPMI (MOPS) + agar 2% glucosa, ph 7±0,1 Inóculo: 0,5 McFarland (1 5 x 10 6 UFC/mL) Incubación (35 ºC): h (Candida spp) h (Cryptococcus neoformans) h (H filamentosos) Lectura: AMB: CMI intersección del halo con la tira de Etest Azoles: CMI inhibición aparente del crecimiento (~80%)

23 ETEST Azoles: F L U C O N A Z O L E Leer a contraluz

24 y en la práctica diaria? Cuándo hacer un antifungigrama?: Hemocultivo Líquidos orgánicos estériles Ante un fracaso terapéutico Estudios epidemiológicos Cómo hacerlo? Sensititre YeastOne Levaduras y Etest filamentosos Neo-Sensitab M44-A2 (FLU, VOR y CAS) levaduras M51-P h filamentosos (no dermatofitos)

25 y en la práctica diaria? Dilución en agar: CHROMagar Candida + fluconazol (8 mg/l) Patterson TF; J Clin Microbiol 1996; 34:3237-9

26 y en la práctica diaria? CHROMagar Candida + fluconazol (8 mg/l) CHROMagar CHROMagar + Fluconazol (8 mg/l) Patterson TF; J Clin Microbiol 1996; 34:3237-9

27 y en la práctica diaria? y si sale un aislado resistente?: Confirmar que es un cultivo puro Confirmar la identificación Confirmar CMI por método estandarizado de dilución (M27-A3 o M38-A2) O enviar aislado a un Lab de Referencia

28 y para saber algo más Expert Rev Anti Infect Ther 2009; 7:

29 5th Trends in Medical Mycology 2 5 October 2011 Valencia Conference Centre Valencia, Spain