Pruebas de sensibilidad in vitro en levaduras y hongos miceliales. Susana Córdoba

Transcripción

1 Pruebas de sensibilidad in vitro en levaduras y hongos miceliales Susana Córdoba INEI. ANLIS. Dr. C. Malbrán scordoba@anlis.gov.ar UCA, 26 de Junio 2013

2 Miércoles 26 de Junio, 2013 Microdilución Levaduras M27-A3, CLSI EDef 7.2 Revision, EUCAST Miceliales M38-A2, CLSI EDef 9.1 EUCAST Difusión Tabletas Discos Etest Ventajas e inconvenientes Departamento Micología. INEI Dr. C. Malbrán SBC, 2013

3 Candida spp., y Cryptococcus neoformans Sensibilidad in vitro Departamento Micología. INEI Dr. C. Malbrán SBC, 2013

4 Pruebas de sensibilidad a los antifúngicos Métodos de Referencia Levaduras Hongos miceliales Microdilución Difusión Microdilución Difusión aislado M27-A3. CLSI EDef. 7.2 EUCAST M44-A3. CLSI M38- A2. CLSI EDef. 9.1 EUCAST M51 A. CLSI Sistemas comerciales Obtención de colonias puras Levaduras/ miceliales Levaduras Difusión Microdilución Tiras Disco/Tableta Placa Tarjetas Galerías Departamento Micología. INEI Dr. C. Malbrán SBC, 2013

5 Levaduras Determinación de la sensibilidad in vitro Microdilución M27-A3/M27-S4, 2012, CLSI Candida spp., Cryptococcus sp. Antifúngico CCCE EDef 7.2. revision, 2012, EUCAST Candida spp., Cryptococcus sp. Difusión en agar M44-A2/M44-S3, 2009 Candida spp.

6 M27-A, CLSI Método: Macrodilución y microdilución Medio: RPMI 1640, ph 7 Inóculo: 0,5-2,5 x 10 3 UFC/mL Placas estériles con fondo en U Incubación: 35º C durante 48 y 72 h Determinación de la CIM: visual Control de calidad: Candida krusei ATCC 6258 Candida parapsilosis ATCC 22019

7 M27-A3. CLSI Preparación del inóculo Incubación 35º-37ºC 24 h Candida spp. 48 h C. neoformans 3-5 colonias 1 mm en 5 ml de solución salina estéril Agar Sabouraud Escala McFarland Ajustar a la DO a 0,5 McFarland, 530 nm 1-5 x 10 6 UFC/mL

8 M27-A3. Preparación de las placas 100 µl Antifúngicos (µg/ml) 2X + RPMI ,5 0,12 0,06 CC CE ATCC Muestra A Muestra B Muestra C 0,25 Muestra D Muestra E Muestra F ATCC 6258

9 M27-A. Inoculación de la microplaca 1-5 x 10 6 CFU/mL 1-5 x 10 3 CFU/mL 1: L inóculo (2X) 1-5 x 10 3 UFC/mL? células /200 µl ,06 CC CE 100 L RPMI + antifúngico (2X) 100 µl RPMI 200 µl RPMI

10 M27-A. Incubación 35ºC Candida spp. : 48/24 horas Cryptococcus neoformans : 72 horas

11 M27-A. Lectura de resultados La CIM es la concentración más baja de antifúngico que inhibe sustancialmente el crecimiento del microorganismo detectado visualmente

12 M27-A. Interpretación de resultados O = ópticamente claro 1 = ligeramente turbio 2 = disminución prominente de la turbidez 3 = ligera disminución de la turbidez 4 = sin disminución de la turbidez

13 CLSI, Lectura visual CC CE 4 0

14 CLSI, Lectura visual CIM Ligeramente turbio CC CE ? 3? 4 0 Ligera disminución de la turbidez

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17 EDef 7.2, Revision EUCAST, 2012

18 M27-A3. Preparación de las placas 100 µl Antifúngicos (µg/ml) 2X + RPMI ,5 0,12 0,06 CC CE ATCC Muestra A Muestra B Muestra C 0,25 Muestra D Muestra E Muestra F ATCC 6258 Departamento Micología. INEI Dr. C.. Malbrán SBC, 2013

19 Inóculo EDef 7.2, EUCAST Subcultivo en SAB h, C 5 colonias aisladas 1 mm diámetro en 5 ml, ADE DO de 0,15 a 530 nm ~ 1-5 x 10 6 UFC/mL Diluir 1: 10 en agua ~ 1-5 x 10 5 UFC/mL Dispensar 100 µl por pocillo ~ 0,5-2,5 x 10 5 UFC/mL Incubación C Estáticas 24 h

20 EDef 7.2 EUCAST, Lectura Espectrofotómetro a 530 nm (405 o 450 nm ) Restar el blanco (columna 12) del resto de pocillos La DO del CC debe ser 0.2 Si no creció a 0.2, reincubar otras 24 h. CIM para azoles, 5FC y equinocandinas, es la inhibición del 50% comparada con el control de crecimiento

21 Optical Density Lectura con espectrofotómetro % 50% MIC GC

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23 Características del M27-A3 (CLSI) y del EDef. 7.2 Revision (EUCAST) Variable M27-A3, CLSI EDef. 7.2, EUCAST Método Macrodilución en caldo, 1 ml Microdilución en caldo, 0,2 ml Microdilución en caldo, 0,2 ml Medio RPMI 1640 con 0,165 M MOPS, ph 7 RPMI % glucosa con 0,165 M MOPS, ph 7 Microorganismos Candida spp., Cryptococcus neoformans Candida spp., Cryptococcus neoformans Inóculo 0,5-2,5 x 10 3 UFC/mL 0,5-2,5 x 10 5 UFC/mL Temperatura de incubación 35ºC 35ºC Tiempo de incubación Candida spp., 24 y 48 h Cryptococcus neoformans h Candida spp., 24 y 48 h Cryptococcus neoformans 48 h Determinación de la CIM Visual Espectrofotométrica Microplacas Fondo U Fondo plano Departamento Micología. INEI Dr. C.. Malbrán SBC, 2013

24 Métodos para estudios de sensibilidad en hongos miceliales

25 Pruebas de sensibilidad para hongos miceliales (microdilución) CLSI Estado actual EUCAST 1991, 1995, 1997 Espinel-Ingroff, Preparación del inóculo; Bases para macro y A microdilución 1998, M38-P, (propuesto) 2002, M38-A, Estándar aprobado 2010 Documento M51- Difusión en agar!!!! 2008 Estándar aprobado 2da edición M38-A EDis EDef 9.1

26 Pruebas de sensibilidad para hongos miceliales ANTIFÚNGICOS ANFOTERICINA B FLUOROCITOSINA EQUINOCANDINAS CICLOPIROX GRISEOFULVINA TERBINAFINA FLUCONAZOL ITRACONAZOL KETOCONAZOL POSACONAZOL RAVUCONAZOL VORICONAZOL

27 Pruebas de sensibilidad para hongos miceliales MEDIO DE CULTIVO RPMI 1640 L-glutamina + 0,165 M MOPS

28 M38-A2 Preparación del inóculo No-dermatofitos 1 ml 0,85% Sol. salina estéril 3-5 ml Sol. sal. estéril

29 Ajuste de inóculo (530 nm) Especie Densidad óptica Aspergillus spp., Paecilomyces lilacinus, P. variotti Exophiala dermatitidis, Sporothrix schenckii 0,09-0,13 Fusarium spp., S. apiospermum, Ochroconis gallopava, Cladosporium bantiana, R. oryzae y otros Zygomycetes 0,15-0,17 Bipolaris spp., Alternaria spp. 0,25-0,3 Con estos valores se obtienen valores de inóculo: 10 6 UFC/mL 1:50 0,4-5 x10 4 UFC/mL

30 Preparación del inóculo Dermatofitos: 10 3 esporas/ml en hematocitómetro

31 Control del inóculo inóculo 1:10 10 L Incubar a 28-30ºC / 24 h 7 días

32 CLSI, Inoculación de la placa Inóculo (2X) con/sin Azul de Alamar 100 L ,5 0,25 0,12 0, ,5 0,25 0, L RPMI + antifúngico (2X) CC CE

33 CLSI, Determinación de la CIM Lectura VISUAL Las placas se colocan en un espejo para lectura de placas de microdilución

34 Candinas: anidulafungina, caspofungina, micafungina Concentración mínima efectiva (MEC) Mejor reproducibilidad MEC: es la menor concentración de antifúngico que produce lesión apical de las hifas con formación de agregados miceliales redondos y pequeños

35 Caspofungina ug/ml. MEC. Aspergillus flavus. Control crecimiento 0,015 0,03 0,06 0,12 0,25 0,5 1 MEC 2 4

36 M38-A2. Interpretación de los resultados Todavía no están establecidos los puntos de corte Hay propuestas de puntos de corte para AMB, ITZ, POSA, VCZ, y CASPO. Sensibles CIM o MEC 1 mg/l Intermedio CIM o MEC 2 mg/l Resistente CIM o MEC 4 mg/l Para Aspergillus spp., ITZ, POSA, VCZ, AMB y CASPO. Scedosporium apiospermum, Paecilomyces lilacinus, POSA, VCZ. Alternaria spp., Bipolaris spicifera, ITZ, POSA, VCZ. Mucoromicetes spp., AMB y POSA.

37 EDef 9.1 (EUCAST) para miceliales

38 Composición y tamaño del inóculo Fusarium spp. Macroconidios de 11 a 80 µm Microconidios de 4 a 8 µm Esporas Aspergillus spp. e Conidios de 2-7 µm hifas mezcladas Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C. Malbrán SBC, 2013

39 EUCAST. Preparación del inóculo 4-5 ml de Agua destilada APD; 35ºC Viernes al Lunes Departamento Micología. INEI ANLIS Dr. C. Malbrán SBC, 2013

40 EUCAST.Preparación del inóculo Filtro 11 µm

41 Características del M28-A2 (CLSI) y del EDef 9.1 (EUCAST) Variable M38-A2, CLSI EDef. 9.1, EUCAST Método Medio Microorganismos Macrodilución en caldo, 1 ml Microdilución en caldo, 0,2 ml RPMI 1640 con 0,165 M MOPS, ph 7 Aspergillus spp., Fusarium spp., Rhizopus spp., Pseudallescheria boydii, Zygomycetes, hongos oportunistas hialinos y dematiaceos, forma micelial de Sporothrix spp, dermatofitos. Microdilución en caldo, 0,2 ml RPMI % glucosa con 0,165 M MOPS, ph 7 Hongos miceliales formadores de conidias Inóculo 0,4-5 x 10 4 UFC/ml 0,5-2,5 x 10 5 UFC/ml Temperatura y tiempo de incubación Alternaria spp. se incuba a 30ºC, 48 a 72 h. Rhizopus spp., 35ºC, 21 a 26 h. Fusarium spp., Aspergillus spp. y la mayoría de los miceliales oportunistas 35ºC, 46 a 50 h. Scedosporium spp. 35ºC, 70 a 74 h. En general, 35ºC, durante h Mucorales 35ºC, 24 h Lectura de la CMI Según la especie de 24 a 96 h Según la especie de 24 a 48 h Determinación de la CIM Visual Visual Microplacas Fondo U Fondo plano Departamento Micología. INEI Dr. C.. Malbrán SBC, 2013

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43 Sistemas comerciales

44 Determinación de la CIM. Sistemas comerciales Paneles de microdilución Vitek 2, (biomérieux): Candida spp. y Cryptococcus spp., VITEK 2 AST-YS01 ref Difusión en agar Etest (biomérieux) Candida spp., Cryptococcus spp Fluconazol Fluorocitosina Anfotericina B Voriconazol ATBFungus 3 (biomérieux): Candida spp. y Cryptococcus spp. Anfotericina B Voriconazol Fluconazol Fluorocitosina Itraconazol Antifúngico. Puntos de corte: Según M27-A3 (CLSI)

45 Difusión en agar Tabletas Neo-Sensitabs Medio de cultivo: Agar Mueller Hinton + 2% G + Azul Metileno Inóculo: 10 6 UFC/mL Tiempo de incubación: 24, 48 h Temperatura: 35 C Fluconazol Malbrán 25 ug

46 Pruebas de difusión Factores determinantes 20 ml de medio 9 cm Ø Espesor del agar 4 mm 15 cm Ø 60 ml de medio

47 Siembra de las placas Siembra con hisopo Colocación de discos/tabletas 20mm Siembra por inundación 40 mm

48 Difusión en agar Incubación posición correcta Departamento Micología. INEI Dr. C.. Malbrán SBC, 2013

49 Lecturas de las zonas de inhibición Lectura manual Lectura automatizada

50 Fluconazol Lectura del halo de inhibición

51 Primero determinar la mejor zona de lectura, tomando una diagonal que corte al disco por su centro Segundo, determinar el halo de inhibición, teniendo en cuenta que corresponde a la zona donde comienza a disminuir el crecimiento de las colonias. Tercero marcar los puntos que corresponden al diámetro y medirlo La zona de crecimiento irregular (teniendo en cuenta la cantidad y el tamaño de las colonias), no se considera como resistencia

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53 Difusión en agar Tabletas Neo-Sensitabs. Halos de inhibición en aislamientos de Candida spp., (S) sensibles y ( R) resistentes a itraconazol-fluconazol R S

54 Etest Colocación de las tiras Antifúngico Placa de 150 mm Placa de 90 mm Medio de cultivo: RPMI 1640 L-glutamina + 0,165 M MOPS

55 Lectura de los halos de inhibición con tiras de Etest R S Tiras de Etest. Halos de inhibición en aislamientos de Candida spp., (S) sensibles y ( R) resistentes a anfotericina B T S Tiras de Etest. Halos de inhibición en aislamientos de Candida spp., (S) sensibles a fluconazol con efecto de arratre (trailing) (T)

56 Vitek2 vs. CLSI, EUCAST, Sensititre y Etest Cuenca-Estrella M, J Clin Microb, 2010 n= Candida albicans, 18 C. tropicalis, 17 C. parapsilosis, 16 C. glabrata, 22 C. krusei, 8 C. lusitaniae, 5 C. guilliermondii, 3 C. famata, 1 C. dubliniensis, 1 C. kefyr, 16 Cryptococcus neoformans, 3 Rhodotorula mucilaginosa, 3 Dipodascus capitatus

57 ATBFungus3, Tabletas Neo-sensitabs Rosco, discos vs. E.Def 7.1 (EUCAST) Concordancia entre el ATBFungus3 y el método de referencia: 90,2%. ATBFungus 3 AMB 5-FC FCZ ITZ Difusión FCZ Disco Malbrán Tableta Neo Sensitabs errores Very Major errores Major errores Minor Candida spp.: C. albicans (n=37), C. tropicalis (n=18), C. glabrata (n=10), C. parapsilosis (n=9), C. krusei (n=4), C. famata (n=1), C. guilliermondii (n=1), C. inconspicua (n=1), P. ohmeri (n=1)

58 Otros métodos Tabletas, discos Malbrán, Oxoid vs. EDef 7.1 (EUCAST) Candida spp. n=200 Porcentaje de concordancia con el método de referencia DISCOS MALBRÁN TABLETAS ROSCO DISCOS OXOID FCZ FCZ VCZ FCZ VCZ 91,0 78,4 95,08 81,96 95,08 Córdoba S y col, 2010 REIE, p 30:32.

59 Métodos de difusión Ventajas Simples de realizar y resultados rápidos. Inconvenientes Subjetividad en la lectura de los halos Lectura a 24 o 48 horas según las especies No todas las especies crecen bien en agar RPMI 2% G Identificar el inóculo Carga de antifúngico apropiada Reproducibilidad intra e interlaboratorio a gran escala

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61 Y ahora a.

62 MUCHAS GRACIAS!!