Antifungigrama: Detección n e interpretación n de resistencia

Transcripción

1 Antifungigrama: Detección n e interpretación n de resistencia T.M María Cristina Diaz J. Profesor Asistente Programa de Microbiologia y Micologia ICBM, Facultad de Medicina Universidad de Chile Porqué? Cuándo? Cómo? Qué?

2 Tratamiento de infecciones fúngicas invasoras Unicas opciones terapeúticas : Anfotericina B - 5 Fluorocitosina Pruebas de susceptibilidad in vitro : no se justificaba Nuevos antifúngicos - nuevas formulaciones NECESARIO a) comparar actividad b) detectar resistencia Antifúngicos :últimos 50 años Griseofulvina Nistatina Anfotericina B (1958) 5-FC L-AmB ABCD ABLC Terbinafine Itraconazol Fluconazol Ketoconazol Miconazol XMP Sordarins Anidulafungin Caspofungin Voricon Posacon Ravucon Micafun

3 Pruebas de susceptibilidad in vitro Objetivo : Conocer si las levaduras y hongos filamentosos son sensibles o resistentes a los antifúngicos Sensibilidad - Resistencia Predecir la respuesta clínica Determinación de la Concentración inhibitoria mínima ( CIM ) permite identificar Aislamientos Resistentes Concepto Microbiológico- Concepto Clínico

4 Concepto Microbiológico 300 número de aislamientos ,03 0,06 0,12 0,25 0, CMIs de Fluconazol Concepto Clínico de resistencia Un hongo es resistente a un antifúngico cuando continúa creciendo y produciendo sintomatología a pesar de que la concentración del antifúngico es máxima en el lugar de la infección

5 Clasificación de la Resistencia Resistencia intrínseca (insensibilidad) cuando ningún miembro de una especie es sensible a un antifúngico. Ej C. krusei y fluconazol Resistencia primaria Un aislamiento de una especie normalmente sensible a un antifúngico, adquiere resistencia natural al mismo. NUNCA tuvo contacto previo con la misma ( mutaciones espontáneas. C. albicans y 5 FC Candida glabrata?

6 Resistencia secundaria Cuando un aislamiento previamente sensible adquiere resistencia al antifúngico después de entrar en contacto con él. Ej. C. albicans y 5FC; C. albicans y fluconazol C albicans + SIDA A. fumigatus + ITZ (profilaxis 2ria) POLIENOS :Anfotericina B Resistencia intrínseca nseca Scedosporium spp. Trichosporon spp Fusarium spp. Aspergillus terreus Hongos dematiáceos Resistencia primaria No existe en aquellas especies que son sensibles a este grupo de antifúngicos

7 POLIENOS :Anfotericina B Resistencia secundaria C. lusitaniae C. guilliermondii C. parapsilosis C. albicans C. tropicalis C. glabrata C. krusei C. rugosa C. neoformans Pacientes con tratamientos prolongados con polienos o con pre exposición n a los azoles. Anfotericina B : Resistencia? La mayoría a de los hongos patógenos y oportunistas son inhibidos in vitro por concentraciones 1µg/ml o menos

8 Resistencia Anfotericina B: Consideraciones Metodología para identificar cepas resistentes aún está en discusión No existen puntos de corte Se recomienda guardar los aislamientos previos al tratamiento con Anfotericina B: Realizar sensibilidad para detectar una elevación de la CIM. Caracterización molecular 5-Fluorocitosina : Espectro de acción Especies de: Candida Cryptococcus Hongos dematiáceos Candida spp. CIMs 0,12-2 µg/ml Candida krusei CIMs > 8 µg/ml Cryptococcus neoformans CIMs 0,5-8 µg/ml

9 5- Fluorocitosina Resistencia primaria Candida, Cryptococcus Aspergillus spp. Hongos dimórficos Resistencia secundaria Muy frecuente en monoterapia Fácil desarrollo de resistencia secundaria Resistencia CIM 32 µg/ml Usar en combinación n con Anfotericina B o Azoles Azoles : Espectro de acción Amplio espectro Levaduras Dermatofitos Aspergillus Otros hongos filamentosos Resistencia intrínseca Fluconazol no actúa frente Candida krusei, Aspergillus, Sporothrix schenkii Zygomycetes (Rhizopus) Otros hongos filamentosos ( Fusarium )

10 Azoles : Resistencia primaria El uso generalizado de algunos azoles, en especial en forma oral o tópica, y la existencia de resistencia cruzada en este grupo hace prácticamente imposible comprobar si la resistencia es primaria o secundaria Es importante la distinción entre insensibilidad (resistencia intrínseca) y resistencia primaria o secundaria Azoles Resistencia secundaria Candida spp y Cryptococcus Resistencia cruzada con otros azoles POLIENOS AZOLES AZOLES ALILAMINAS ALILAMINAS E R G O S T E R O L SIDA; Candidiasis vaginal recurrente, Neutropenia, Transplante

11 Equinocandinas Caspofungina (Merk & Co, MK-0991) Anidulafungina (Pfizer) Micafungina Candida spp. : cepas sensibles y resistentes a los polienos y azoles Aspergillus spp. in vivo. Difícil de evaluar in vitro Pneumocystis jirovecii H. capsulatum, B. dermatitidis, C. immitis Ausencia de actividad frente a Basidiomicetos, C. neoformans, Fusarium spp., Mucorales. Detección de la Resistencia CLSI M27-A2: M38-A: EUCAST: Levaduras Macro y microdilución Hongos filamentosos Microdilución Levaduras fermentadoras Microdilución C I M E-TEST Difusión TABLETAS: Neo Sensitabs- Rosco DISCOS DE PAPEL: M44-A- CLSI SISTEMAS COMERCIALES A G A R

12 Valores de corte y Criterios de sensibilidadresistencia de las levaduras Sólo determinados para Candidiasis orofaringeas en pacientes con SIDA FCZ,ITZ,5 FC Candidemia : FCZ Medio de cultivo ph Variables a considerar Buffer o tampón Inóculo Tiempo y temperatura de incubación CLSI, M27-A Método de Referencia para levaduras Especies de Candida y Cryptococcus neoformans Método: Macrodilución Microdilución ( fondo redondo ) Antifúngicos : Antifúngico Intervalo (ug/ml) Anfotericina B 16-0,0313 Flu orocitosina 64-0,125 K etoconazol 16-0,0313 Flu conazol 64-0,125 Itraconazol 16-0,0313 V oriconazol 16-0,0313 R avucon azol 16-0,0313 Posacon azol 16-0, A BC D EFG H ,50,250,12 0,060,03 CCCE

13 Medio: RPMI 1640 con glutamina,sin bicarbonato ph 7.0 Inóculo: 0.5 Mc Farland ( 1x x 10 6 UFC/ml) Dilución 1:1000 RPMI ( 1x x 10 3 Concentración final 0,5-2,5 x 10 3 UFC/ml Incubación: 35º C durante 48 y 72 h 8.- Cepas de control de calidad Candida krusei ATCC 6258 Candida parapsilosis ATCC Lectura de resultados a) Lectura visual : CIM : concentración más baja de antifúngico que inhibe sustancialmente el crecimiento de la levadura Azoles y 5 FC : > 50 % inhibición Anfotericina B : 100 % inhibición O = ópticamente claro 1 = ligeramente turbio 2 = disminución prominente de la turbidez 3 = ligera disminución de la turbidez 4 = sin disminución de la turbidez

14 b) Lectura espectrofotométrica Longitud de onda ( 405, 490 y 530nm) ATFs fungistáticos : < 50% del pocillo control de crecimiento ATFs fungicidas : < 5% del control. Obsevaciones Candida albicans y Candida tropicalis Lectura de las CIM en los azoles : fuente de variabilidad Se mantiene un cierto crecimiento en concentraciones superiores a la CIM Trailling effectt, cola de crecimiento, crecimiento residual ,5 0,25 0,12 CC CE

15 M27-A2: Puntos de corte Sensible S-DD Interm. Resistente Fluconazol 8, Itraconazol 0,125 0,25 0, ,0 Flucitosina 4, Voriconazol AMB y KTZ: Puntos de corte? M27-A2 Interpretación de resultados Categorias Sensible - S No lleva implícito el éxito terapeútico Intermedio - I ( sólo aplicable a 5-FC ) Resistente - R Se correlaciona con fracaso terapeútico Sensible dosis dependiente - S-DD FCZ : se basa en niveles del antifúngico que se alcanzan con dosis > 400 mg/ dia en pacientes con buen funcionamiento renal. ITZ : niveles en sangre > 0.5 ug/ml

16 Limitaciones M 27-A2 : No es un método adecuado para detectar resistencia a Anfotericina B Medio de cultivo RPMI 1640 presenta problemas para el crecimiento de Cryptococcus neoformans. Medio propuesto : AM3 - Yeast nitrogen base EUCAST Definitive E. Def.7.1 : method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts. Subcommittee of Susceptibility Testing ( AFST )of the ESCMID (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) Metodología: microdilución Placas fondo plano Medio: RPMI % glucosa EUCAST Inóculo: 0,5-2,5 X 10 5 UFC/ml Incubación: 35ºC ; 24hrs (Candida spp) Reincubar 24 hrs más si la absorbancia es < 0.2, indica escaso crecimiento ( C. parapsilosis, C. guilliermomdii )

17 EUCAST Levaduras fermentadoras de la glucosa Determinación CIM: espectrofotométrico (lectura en espectrofotómetro λ= 530 nm, D.O (turbidez) Lectura Anfotericina : inhibición de > 90% Flucitosina, azoles y equinocandinas : > 50% Control de calidad: C. krusei ATCC 6258 C. parapsilosis ATCC Puntos de corte EUCAST Clinical MIC Breakpoints for Fluconazole, 17 April 2007 S R C. albicans 2 4 C.tropicalis 2 4 C.parapsilosis 2 4 C. glabrata IE C. krusei- - No especies 2 4 EUCAST Technical Note on Fluconazole Clin Microbiol Infect 2008; 14:

18 EUCAST: elección de la CIM Visual vs. espectrofotométrica VENTAJAS El agregado de glucosa y el aumento del inóculo acortan el tiempo de lectura de la CIM a 24 horas Lectura final OBJETIVA (CIM 50%) Lectura final AUTOMATIZADA. NCCLS vs EUCAST NCCLS ( CLSI ) EUCAST Temperatura Tiempo Incubación 35ºC 48h 35ºC 24 h Inóculo Medio Lectura Criterio de lectura Hongo 0,5-2,5 X 10 3 UFC/ml RPMI 1640 Visual Inhibición total (AMB) Inhibición prominente( 50%) (azoles) Candida spp, C. neoformans y 6 géneros de mohos 0,5-2,5 X 10 5 UFC/ml RPMI 1640 (2% glucosa) Espectrofométrico 90% inhibición (AMB) 50% inhibición (azoles) Candida Chryssanthou & Cuenca-Estrella JCM 40:3841, 2002

19 M 38-A -Método de microdilución para hongos miceliales- CLSI Especies del género Aspergillus, Fusarium, Rhizopus, Pseudoallescheria boydii, Sporotrix schenckii Método: microdilución Medio: RPMI % glucosa Inóculo: 0,4 x x 10 4 ufc/ml Preparación del inóculo : Aspergillus, Rhizopus, Pseudoallescheria boydii, Sporotrix schenckii : Cultivo 7 dias a 35 C en agar papa dextrosa. Fusarium : Cultivo en agar papa dextrosa hrs a 35 C y luego a C hasta los 7 dias. Incubación: 35ºC; 24, 48 y 72 h Determinación de la CIM: visual CIM: la menor concentración sin crecimiento Anfotericina B Itraconazol y voriconazol Equinocandinas Control de calidad: Aspergillus flavus ATCC Aspergillus fumigatus ATCC Candida parapsilosis ATCC Candida krusei ATCC 6258

20 EUCAST Discusion document : Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for conidia forming moulds. Método: Microdilución fondo plano Medio: RPMI % Glucosa Inóculo: 1-2,5 x 10 5 UFC/ml Preparación del inóculo : Subcultivos a 35 C en agar papa dextrosa ( 2-5 dias ). Cubrir con 5 ml agua estéril + Tween 20. Recuento en hemocitómetro de hifas y conidios. Incubación: 35º-37ºC; 24 y 48 h Control de calidad: C. krusei ATCC 6258 C. parapsilosis ATCC Lectura de los resultados : visual Para todos los antifúngicos : CIM Concentración más baja en la que se observa una inhibición total del crecimiento de la cepa.

21 Equinocandinas : se puede utilizar la CME ( concentración mínima efectiva ) : concentración en que se empiezan a ver alteraciones microscópicas y/o macroscópicas de la cepa. Esta modificación no ha sido estandarizada. No existen puntos de corte por ninguno de los 2 métodos. M 38-A: Puntos de corte Hongos filamentosos No existen puntos de corte para interpretar las pruebas de sensibilidad. Anfotericina B :Cepas de Aspergillus spp y Rhizopus se comportan como resistentes en modelos animales, con una CIM de > 2 mg/l. A. terreus : CIMs más altas. Itraconazol :se han comunicado fallos terapeúticos con ITZ en infecciones producidas por cepas de Aspergillus con CIM de > 8 mg/l. Voriconazol : algunos aislamientos con CIM altas a ITZ y mutaciones en el gen cyp51 A han elevado CIM a VCZ. Posaconazol: idem VCZ Caspofungina y Micafungina : no hay datos de correlación entre CIM/ MEC.

22 Neosensitabs- Rosco Metodología: Difusión Medio: SHADOMY Inóculo: 5 x 10 5 UFC/ml Candida : Mc Farland 0.5 diluído 1+1 con sol salina) Cryptococcus : Mc Farland 1.0 Método de Siembra: Inundación. Incubación: 35ºC ; 24 y 48 h Determinación del halo: Visual AMB FCZ 5FC KZ Criterios de Interpretación Sensible Intermedio Resistente 5 FC >30 mm mm < 22 mm Azoles >20 mm 12-19mm < 11mm AMB > 15 mm 10-14mm sin halo Itraconazol > 15 mm 10-14mm sin halo Nistatina > 15 mm 10-14mm sin halo Griseo >10 mm - sin halo

23 M 44-A ( CLSI ) :Método de difusión en agar Método sencillo y práctico, validado para Fluconazol y Voriconazol - Candida spp Medio de cultivo : Agar Mueller Hinton con 2% glucosa y 0.5 ug/ml de azul de metileno mejora la lectura de las placas al aumentar la nitidez de los halos de inhibición) Discos Fluconazol 25µg Voriconazol 1 µg Posaconazol 25 ug Inóculo 0.5 MacFarland en solución salina (1-5 x 10 6 ufc/ml ) M 44-A ( CLSI ) :Método de difusión en agar Siembra : 3 direcciones en la placa, dejar secar 15 min. Incubación : a 35 C, 24 hrs para Candida spp y 48 hrs para C. neoformans. Si no hay crecimiento, incubar 24 hrs más Lectura : medir los halos de inhibición de crecimiento en mm. Control de Calidad C.albicans ATCC C.parapsilosis ATCC C.tropicalis ATCC 750 y C.krusei ATCC 6258

24 Criterios de interpretación Control de Calidad Otros métodos Dilución en agar : método fácil, económico y rápido. Candida spp y Cryptococcus spp Sólo aplicable a Fluconazol - Placas con Yeast Morphology Agar (YMA) con distintas concentraciones de FCZ ( ug/ml) - Placas con CHROMagar con distintas concentraciones de FCZ (8-16ug/ ml )

25 Otros Métodos alternativos Sistemas comerciales Métodos colorimétricos Basados en el M 27-A, incorporan un indicador redox ( azul de alamar ) en el medio de cultivo, cambia de color cuando existe crecimiento ( azul a rosado). Sensititre YeastOne Trek Diagnostic Systems Técnica reproducible, fácil de realizar y puntos finales claramente visibles con resultados dentro de los rangos esperados.

26 Fungitest Fundamento: Microdilución Colorimétrica Cada placa tiene 2 concentraciones diferentes en pocillos individuales. Contiene un indicador redox para mejorar la lectura del punto final Método no colorimétrico : ATB Fungus ( Bio-Mérieux) Utiliza diluciones seriadas para ANB y 5-FC. 2 concentraciones críticas para el resto. Galeria de 16 pocillos con los antifúngicos deshidratados. Nistatina- ( 4-8) Miconazol - Econazol - Ketoconazol-( 1-8) Anfotericina : 4 concentraciones ( ) CIM 5-Fluorocitosina : 10 concentraciones ( ) CIM

27 ATB FUNGUS Control de calidad : C albicans ATTC Lectura : Visual Cúpulas Resultados Interpretación c C c C claro claro - - Sensible turbio claro + - Intermedia turbio turbio + + Resistente Lectura : automatizada - sistema ATB ATB FUNGUS 3 Control de calidad : C albicans ATTC Antifúngico c C 5 FC 4 16 AMB AMB 1 8 AMB 2 16 FCA 1 16 FCA 2 32 FCA 4 64 FCA ITR ITR ITR VRC VRC VRC VRC Definición de CIM...Valor sin reducción de crecimiento...4 leve reducción... 3 reducción visible... 2 crecimiento muy débil... 1 sin crecimiento... 0

28 Métodos alternativos para hongos filamentosos Sensititre yeast one : Aspergillus Dilución en agar : AM # 3, RPMI, YNB Difusión en discos : M 44- A Anfotericina B, Caspofungina : Aspergillus y otros hongos filamentosos E-test : Aspergillus - Pseudoallescheria boydii, Scedosporium Resistencia en Hongos filamentosos A fumigatus Resistentes a Itraconazol R. cruzada para otros azoles : Voriconazol, Ravuconazol, Posaconazol. Resistencia de Aspergillus a azoles: relacionada con el uso masivo de antifúngicos en tratamientos empíricos y en profilaxis. Uso de FCZ podria incluir una regulación positiva en la expresión de algunos genes y esto implicaria cambios en su patrón de resistencia o tolerancia frente a antifúngicos normalmente eficaces. Esta hipótesis se ha demostrado in vitro con A. fumigatus

29 Procedimientos no aceptables Modificaciones no validadas : cambios en inóculo, medios de cultivos o lectura CIM. No incluir cepas controles... Validación de los resultados. No deben aceptarse si las CIMs de las cepas control no coinciden con los estandares. No usar preparados comerciales de los antifúngicos Control de calidad riguroso de los antifúngicos, lotes de medios de cultivo, otros reactivos y cepas control. Uso de técnica comercial seguir recomendaciones del fabricante.

30 En resumen... Levaduras provenientes de hemocultivo: Sensibles a AMB y a FCZ RECORDAR!!!!! Fluconazol Insensible: Candida krusei Resistencia secundaria: C. glabrata C. guilliermondii C. albicans C. tropicalis Itraconazol Cepas intrínsecamente nsecamente resistentes? RESISTENCIA CRUZADA CON FLUCONAZOL Anfotericina B Resistencia primaria y secundaria: MUY BAJA C. lusitaniae, C. haemulonii y Trichosporon spp.: CIM muy elevadas C. tropicalis: fácil inducción C. parapsilosis: poco fungicida Hongos miceliales... RECORDAR!!!!! Fluconazol Escasa o nula actividad frente a hongos miceliales Anfotericina B Resistencia primaria y secundaria: Scedosporium apiospermun Scedosporium prolificans Fusarium spp. Hongos dematiáceos

31 Utilidad del Antifungigrama RECORDAR!!! Cepas procedentes de pacientes con un fracaso terapéutico. Pacientes que han recibido profilaxis antifúngica previa Aislamientos de especies poco frecuentes, se desconoce su patrón de sensibilidad. Elegir la mejor alternativa terapéutica Información para cambiar tratamiento.