Pruebas de sensibilidad a antifúngicos

Transcripción

1 Pruebas de sensibilidad a antifúngicos Las pruebas de sensibilidad tienen como objetivo conocer si los microorganismos ensayados son sensibles o resistentes a los antimicrobianos y sirven para elegir de forma óptima el tratamiento antifúngico. Metodologías para la determinación de sensibilidad antifúngica Existen dos procedimientos generales para determinar la sensibilidad de los microorganismos a los antimicrobianos y estos son: - Dilución en agar o caldo - Difusión en agar Dilución en agar o caldo Se realiza la dilución del antimicrobiano en un medio de cultivo adecuado para el crecimiento del microorganismo que se va a ensayar. Se inocula el microorganismo, se incuba a una temperatura determinada y se determina la concentración del antimicrobiano que produce la inhibición del crecimiento del microorganismo definida como CIM (Concentración Inhibitoria Mínima). - Inoculación - Incubación Diluciones del antifúngico CIM = 16 µg/ml Esta metodología puede realizarse en macroescala, utilizando tubos, o en microescala, usando microplacas de 96 pocillos. La posibilidad de cuantificar la actividad antifúngica a través de la determinación de la CIM es la principal ventaja de los métodos de dilución ya que estos valores cuantitativos se pueden utilizar, junto con la farmacocinética del antimicrobiano, para calcular índices terapéuticos. Difusión en agar con disco Se inocula el microorganismo en la superficie del agar y se deposita un disco con una concentración conocida de antimicrobiano. Después de incubar a una temperatura adecuada, se produce una zona de inhibición del crecimiento del microorganismo alrededor del disco. Dependiendo del tamaño de la zona, se puede determinar si el microorganismo es sensible, intermedio, indeterminado o resistente al antimicrobiano ya que los diámetros tienen una

2 relación inversa con la CIM. La principal ventaja de la difusión con disco es el bajo costo unido a la simplicidad de la técnica y esto incluye desde la realización, la lectura y en la mayoría de las ocasiones, la interpretación. incubación Placa con medio de cultivo inoculada Discos conteniendo antifúngicos Halos de inhibición Estándares de Referencia El Instituto de Estándares Clínicos de Laboratorio, CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute), desarrolló Estándares de Referencia que describen detalladamente los parámetros experimentales para la correcta realización de ambos métodos para lograr, de esta forma, una mayor exactitud y reproducibilidad de los resultados. Documento M27-A3: Método de referencia para determinar la sensibilidad de las levaduras a los antifúngicos a través del método de dilución en caldo. Introducción El método que describe este estándar está pensado para evaluar levaduras que causan infecciones invasoras: todas las especies de Candida y Cryptococcus neoformans. Este método no se aplica para evaluar la fase levaduriforme de los hongos dimórficos como Histoplasma capsulatum. Para algunos hongos filamentosos se puede utilizar el método de dilución cuyas directrices se encuentran descriptas en el documento M38-A. Medio de cultivo El medio recomendado es completamente sintético: RPMI con glutamina, sin bicarbonato y rojo fenol como indicador de ph. Preparación del inóculo 1. Subcultivar todos los microorganismos en agar Sabouraud a 35ºC durante 24 horas para Candida spp. y 48 horas para Cryptococcus neoformans. Hay que asegurarse de su absoluta pureza y que los aislamientos no están contaminados.

3 2. Preparar el inóculo se debe tocando 5 colonias de 1 mm de diámetro de cultivos incubados y suspendiéndolas en 5 ml de solución salina estéril 0,85% (0,145 mol/l de NaCl; 8,5 g/l=0,85% solución salina). 3. La suspensión resultante se debe de agitar vigorosamente durante 15 segundos y ajustar la densidad de la suspensión celular a una transmitancia equivalente a 0,5 de la escala de McFarland a 530 nm. Este ajuste produce una solución salina que contiene entre 1-5 x 10 6 UFC/ml que se diluye 1:2000 con RPMI 1640 lo que produce una concentración celular entre 0,5 x ,5 x 10 3 UFC/ml. Soluciones de antifúngicos Las soluciones madre de los antifúngicos se deben de preparar a concentraciones de al menos 1280 µg/ml o 10 veces la concentración mayor ensayada en dimetilsulfóxido y luego en el medio de cultivo apropiado. El intervalo de concentraciones elegidos para cada antimicrobiano debe incluir los puntos críticos, o sea aquellos que definen si una cepa es sensible o resistente. Basados en estudios previos, se recomiendan las concentraciones de antifúngicos que están recogidas en la siguiente tabla. Antifúngico Intervalo (µg/ml) Anfotericina B 16-0,03 5-fluorocitosina 64-0,12 Ketoconazol 16-0,03 Fluconazol 64-0,12 Itraconazol 16-0,03 Voriconazol 16-0,03 Posaconazol 16-0,03 Ravuconazol 16-0,03 Anidulafungina 16-0,03 Caspofungina 16-0,03 Realización de la técnica de microdilución Se utilizan placas de microdilución estériles de 96 pocillos. Se dispensan 100 µl de los antifúngicos a una concentración 2x en las columnas de la 1 a la 10 con una pipeta multicanal. La columna 1 contiene la concentración más alta del antifúngico (64 o 16 µg/ml) y la fila 10 la más baja (0,12 o 0,03 µg/ml). Cada pocillo de la placa se inocula con 100 µl de la suspensión del inóculo. El pocillo 11 control de crecimiento, que solo contiene 100 µl de RPMI 1640, se añaden 100 µl del inóculo. El pocillo 12 es control de esterilidad de la técnica y por tanto debe contener solo RPMI.

4 A B C D E F G H A B C D E F G H ,5 0,25 0,12 Control de crecimiento Control de esterilidad ,5 0,25 0,12 0,06 0,03 Control de crecimiento Control de esterilidad Incubación Candida spp. se debe de incubar, sin agitación, en atmósfera normal, a 35ºC durante horas y Cryptococcus neoformans, en las mismas condiciones durante horas. Tras este periodo de incubación se procede a leer los resultados. Lectura de los resultados La CIM es la concentración más baja de antifúngico que inhibe sustancialmente el crecimiento del microorganismo detectado visualmente. Se compara el crecimiento en cada concentración de antifúngico con el crecimiento en el tubo control de crecimiento y se califica de la siguiente forma: 0 = ópticamente claro 1 = ligeramente turbio 2 = disminución prominente de la turbidez 3 = ligera disminución de la turbidez 4 = sin disminución de la turbidez La CIM para la anfotericina B, se define como la concentración más baja que tiene una puntuación de 0 (ópticamente claro). Para la 5-fluorocitosina, los azoles y las equinocandinas es la concentración más baja que tiene una puntuación de 2 (disminución prominente de la turbidez). Para aquellos aislamientos que producen grumos en el fondo, la dispersión de los mismos pipeteando o agitando puede ayudar a la interpretación de los resultados.

5 Puntos de corte (µg/ml) recomendados por el CLSI. Documento M27-A3 Antifúngico Sensible Sensible Intermedio Resistente dependiente de la dosis Anfotericina B > 1 Fluconazol Itraconazol 0,125 0,25-0, fluorocitosina Voriconazol Equinocandinas Control de calidad Los objetivos del programa de control de calidad son evaluar: 1. la precisión y exactitud del procedimiento de ensayo. 2. si los reactivos, las condiciones del ensayo y las instrucciones utilizadas en el procedimiento fueron adecuadas. 3. el personal que realiza las técnicas y lee los resultados. Estos objetivos se alcanzan si se utilizan cepas de control seleccionadas por su estabilidad genética y por su utilidad para controlar el método que se está ensayando. Las cepas de control de calidad son evaluadas de la misma forma y se incluyen siempre que se ensaye un aislado, se utilizan C. parapsilosis ATCC y C. krusei 6258, los resultados obtenidos deben estar dentro del rango recomendado Microorganismo Antifúngico Rango CIM Anfotericina B 0,25 2 Anidulafungina 0,25 2 Caspofungina 0, fluorocitosina 0,06-0,25 C. parapsilosis ATCC Fluconazol 0,5 4 Itraconazol 0,125-0,5 Ketoconazol 0,03-0,25 Posaconazol 0,06-0,25 Ravuconazol 0,016-0,12 Voriconazol Anfotericina B 0,5 2 Anidulafungina Caspofungina C. krusei ATCC fluorocitosina 4 16 Fluconazol 8 64 Itraconazol 0,12 1 Ketoconazol 0,12-1 Posaconazol 0,06-0,5 Ravuconazol 0,06-0,5

6 Documento M44 A Método de difusión en medio sólido El documento M44-A describe el método de difusión en agar para levaduras del género Candida. Las pruebas en medio sólido y en especial las de difusión son simples de realizar y los resultados se obtienen de forma rápida, siendo, en teoría, muy fáciles de interpretar. Sin embargo, en este punto hay que ser muy estrictos, pues si las técnicas no se realizan siguiendo rigurosamente las instrucciones sugeridas por los fabricantes, es posible que se obtengan resultados erróneos. Medio de cultivo Es muy importante la elección del medio de cultivo ya que su composición influye en el tamaño de la zona de inhibición, en la actividad del antimicrobiano, en la velocidad de difusión del antimicrobiano y en la velocidad de crecimiento del microorganismo. Debido a esto, se acordó que el medio de cultivo debe reunir las siguientes características: 1. La receta del medio debe especificar la composición de productos 2. El medio debe permitir el crecimiento de la mayoría de los patógenos. 3. El medio debe estar tamponado de forma que no se produzca un cambio significativo en su ph cuando los microorganismos crezcan. 4. El medio no debe ser antagonista de ninguno de los antimicrobianos ensayados. 5. El medio debe ser isotónico con la sangre, de forma que se pueda añadir sangre completa para permitir el crecimiento de microorganismos fastidiosos. 6. El medio debe producir resultados satisfactorios en los ensayos de sensibilidad con las cepas de control de calidad. 7. El medio debe ser reproducible, es decir el uso de diferentes lotes debe producir resultados similares. Para los antibacterianos el medio recomendado es agar Mueller-Hinton, mientras que para los antifúngicos, se recomienda el uso de Agar Mueller-Hinton con 2% glucosa y 0,5 µg/ml Azul de Metileno. Las placas de Petri deben de tener una profundidad de 4 mm (±1). Para lograr esa profundidad, si la placa es de 9 cm de diámetro se necesitan 25 ml de medio y si es de 15 cm, 60 ml. Es necesario secar la superficie antes de utilizarlas, colocando las placas durante media hora, en la estufa de 37ºC boca abajo y con las tapas ligeramente abiertas para permitir que la humedad se evapore. Preparación del inóculo Para la preparación del inóculo se parte de un cultivo de 24 h, en Agar Sabouraud dextrosa a 35 (± 2º C). De este cultivo, se tocan cinco colonias y se suspenden en 5 ml de solución salina estéril (8.5 g/l NaCl; 0.85%). El resultado de la suspensión se homogeneiza

7 durante 15 segundos, y su turbidez se ajusta a 0,5 de la escala McFarland (equivalente a 1 x 10 6 a 5 x 10 6 UFC). Inoculación de las placas Las placas se deben de inocular de forma que se produzca un crecimiento confluente o semiconfluente. La utilización de inóculos grandes que producen una zona limítrofe engrosada o inóculos pequeños que producen colonias separadas no es adecuada ya que la zona de inhibición resultante no refleja la sensibilidad o resistencia real del aislado. La siembra de las placas puede realizarse de dos formas: Siembra por dispersión con hisopo Se debe aplicar el siguiente procedimiento: se sumerge un hisopo de algodón estéril en el inóculo. El exceso de líquido es eliminado girando el hisopo varias veces contra las paredes interiores del tubo. El inóculo se extiende por toda la superficie de la placa 3 veces seguidas. En cada repetición, se gira la placa 60º, de forma que se asegure la distribución uniforme del inóculo. Siembra por inundación Una vez que se preparó el inóculo, se realiza una dilución 1/10, se extraen entre 2-4 ml del mismo y se vuelcan en la placa de Petri. Se distribuyen homogéneamente por la superficie. El exceso de líquido se retira con una pipeta Pasteur estéril. Se deja secar la superficie durante 15 minutos a temperatura ambiente. Antifúngicos Los antifúngicos pueden colocarse en distintos reservorios: pocillos en el agar, cilindros que contienen el antimicrobiano, tabletas o discos. La aparición del disco de papel de filtro impregnado de antimicrobiano revolucionó esta técnica y en la actualidad es el reservorio de elección para las pruebas de susceptibilidad. Las tabletas son también un método muy utilizado que se encuentra disponible comercialmente. Preparación de los discos de papel de filtro De acuerdo a las recomendaciones de la United States Food and Drug Administration Standards, el papel de filtro debe pesar 30 ± 4 mg/cm2 y debe tener la suficiente capacidad para absorber 2-3 veces su propio peso en agua. Los discos deben tener un diámetro de 6,35 mm. Para prepararlos se puede utilizar un sacabocados cuyo diámetro interno sea de 6,35 mm. Lo más práctico es adquirirlos en el comercio.

8 Colocación de los discos de antimicrobiano Los discos de antimicrobianos se deben colocar no más de 15 minutos tras la inoculación de las placas, de esa forma la difusión y el crecimiento ocurren en simultáneo. Se pueden aplicar con la ayuda de un dispensador o con pinza estéril. Para asegurar un completo contacto se aconseja presionar el disco contra la superficie del agar. Se deben de colocar al menos a una distancia de 15 mm del borde de la placa y separados entre sí por una distancia de 24 mm. Esta disposición reduce la posibilidad de superposición de zonas de inhibición, que dificulta la lectura e interpretación. Una vez colocados en el agar, es importante no moverlos ya que la difusión comienza de forma inmediata. Incubación de las placas Las placas inoculadas deben ser incubadas a 35 ± 2 ºC durante y hasta 48 horas en una posición invertida. Lectura de las zonas de inhibición El diámetro de cada zona de inhibición se mide con una regla, calibre, plantilla o instrumental electrónico. Interpretación de resultados Con el método de difusión no se puede determinar una CIM ya que únicamente se mide el diámetro del halo de inhibición. Por tanto, se establecieron las siguientes categorías: 1. Sensible 2. Intermedio/ Sensible dependiente de dosis 3. Moderadamente sensible 4. Resistente Estas categorías están basadas en los puntos de corte que se establecieron mediante el método de dilución en caldo, las concentraciones séricas que el antibiótico alcanza en suero y la distribución de las CIMs para la especie estudiada. Antifúngico Concentración Halo de inhibición (mm) CIM (µg/ml) R* S-DD* S* R* S-DD* S* Fluconazol 25 µg Anfotericina B 10 µg Itraconazol 8 µg ,25-0,50 0,12 Ketoconazol 15 µg ,5 0,25 0,12 Voriconazol 1 µg *Susceptible: S; *Susceptible-dependiente de dosis: S-DD; *Resistente: R

9 Rangos de diámetros (mm) para las cepas control de calidad Antifúngicos Candida albicans ATCC Candida parapsilosis ATCC Candida krusei ATCC 6258 Fluconazol mm mm Anfotericina B mm mm mm Itraconazol mm mm mm Ketoconazol mm mm mm Voriconazol mm mm mm Los rangos de control de calidad de estos aislamientos no han sido establecidos para estos antimicrobianos debido a la extensa variabilidad inter laboratorio. Etest (AB Biodisk) Es una técnica cuantitativa. Consiste en la utilización de una tira de plástico que, en una de sus caras, lleva un gradiente de concentración del antimicrobiano. Tras la incubación, la intersección entre el crecimiento del microorganismo y la zona de inhibición en forma de elipse indican la CIM.

10 Problemas Problema 1 Se determinó la sensibilidad antifúngica, por el método de difusión en agar, de dos cepas de Candida causantes de Candidiasis orofaringea aisladas de pacientes HIV positivo. a) Determine cuáles fueron los diámetros de los halos de inhibición para los distintos microorganismos frente a los antifúngicos estudiados. Complete el cuadro. Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 C. parapsilosis ATCC C. krusei ATCC 6258 Anfotericina Fluconazol Itraconazol Halo Interpret. Halo Interpret. Halo Interpret. b) De acuerdo a los resultados obtenidos con las cepas control de calidad, puede afirmar que el método fue realizado de forma correcta? c) Qué puede concluir sobre la susceptibilidad antifúngica de las cepas aisladas? d) En pacientes infectados con HIV la infección oral causada por C. albicans es un cuadro recidivante que suele precisar tratamientos con azoles de larga duración o de numerosos ciclos para conseguir su remisión. El crecimiento de la población con SIDA multitratada con azoles ha dado lugar a un aumento notable de las descripciones de casos de candidosis oral o esofágica que no responden al tratamiento con fluconazol. Qué importancia tiene la determinación de susceptibilidad antifúngica en estos casos? Problema 2 a) Se determinó la susceptibilidad antifúngica de dos cepas de C. albicans provenientes de flujo vaginal a través del método de microdilución en caldo. Cuáles fueron las CIMs para las distintas cepas estudiadas frente a Fluconazol e Itraconazol? El diseño de las microplacas se encuentra debajo. - Filas A y B: C. albicans. Cepa 1 - Filas C y D: C. albicans. Cepa 2 - Filas E y F: C. parapsilosis ATCC Filas G y H: C. krusei ATCC 6258 b) De acuerdo a los resultados obtenidos con las cepas control de calidad, puede afirmar que el método fue realizado de forma correcta? c) Qué puede concluir sobre la susceptibilidad antifúngica de las cepas aisladas?

11 Fluconazol Itraconazol A A B B C C D D E E F F G G H ,5 0,25 0,12 Control de crecimiento Control de esterilidad H ,5 0,25 0,12 0,06 0,03 Control de crecimiento Control de esterilidad Fluconazol Itraconazol CIM Interpretación CIM Interpretación Cepa 1 Cepa 2 Candida parapsilosis ATCC Candida krusei ATCC 6258 d) Algunos autores consideran que se está produciendo un cambio en los agentes etiológicos de Candidiasis vaginales siendo cada vez es más frecuente la implicación de especies menos sensibles a los azoles o que desarrollan fácilmente resistencia. Se piensa que puede existir una relación entre resistencia secundaria a los azoles en las cepas de C. albicans procedentes de mujeres inmunocompetentes, tratadas con fluconazol y la recidivas de las vaginitis fúngicas. Qué importancia tiene la determinación de la susceptibilidad antifúngica en estos casos? A qué puede atribuir los resultados obtenidos para la cepa 2? Qué antifúngico utilizaría en cada caso?