BIORREACTRES. Estudios básicos y aplicados sobre procesos de fermentación

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1 BIORREACTRES Ing. en Alimentos Estudios básicos y aplicados sobre procesos de fermentación Mg. Anahí V. Cuellas Docente investigadora Universidad Nacional de Quilmes

2 TRABAJO PRACTICO Obtención de enzimas de importancia Industrial Mg. Anahí V. Cuellas

3 OBJETIVOS Capacitar al alumno en el manejo de distintas técnicas de fermentación. Comparar ventajas y desventajas de las técnicas de fermentación en cultivos sumergidos y en fase sólida. ETAPAS Introducción teórica Cultivo en fase sólida Cultivo sumergido Cultivo sumergido en un fermentador tipo planta piloto de 5 l de capacidad Discusión de resultados

4 El objetivo de los procesos biológicos es obtener productos metabólicos útiles, a partir de material biológico. La obtención de enzimas de uso industrial constituye un campo de creciente avance dentro de la industria alimenticia VENTAJAS DE LOS PROCESOS ENZIMATICOS Se realizan en condiciones normales de ph, temperatura y presión INTRODUCCION TEORICA Emplean menor energía y equipos de menor costo. Se obtienen productos de mayor pureza y menos degradados

5 PRINCIPALES ENZIMAS DE USO INDUSTRIAL ENZIMA APLICACION FUENTE PROTEASAS ALCALINAS DETERGENTES BACTERIAS PROTEASAS ACIDAS ALIMENTOS HONGOS PROTEASAS NEUTRAS VARIOS BACTERIAS, PLANTAS Y ANIMALES PECTINASAS ALIMENTOS HONGOS AMILASAS INDUSTRIA DEL ALMIDON MICROORGANISMOS ISOMERASAS ALIMENTOS, FARMACEUTICA MICROORGANISMOS LIPASAS VARIOS MICROORGANISMOS. PLANTAS Y ANIMALES

6 APLICACIÓN DE LIPASAS EN LA INDUSTRIA Empleo Industrial de lipasas (E.C ): Industria Alimenticia (principalmente en grasas aceites y lácteos) PRODUCCION DE ENZIMAS La producción de enzimas se lleva a cabo a través de procesos de fermentación de microorganismos. Dentro de los microorganismos, los hongos son reconocidos por su alta producción de enzimas extracelulares, principalmente Lipasas y Proteasas, lo que facilita los procesos de obtención de estas proteínas.

7 EXISTEN DOS TIPOS PRINCIPALES DE FERMENTACION A. FERMENTACIÓN SUMERGIDA B. FERMENTACIÓN EN FASE SÓLIDA EL PRESENTE TRABAJO PRACTICO PROPONE OBTENER LIPASAS, APARTIR DEL HONGO ASPERGILLUS NIGER*, ATRAVES DE TECNICAS DE CULTIVO SUMERGIDO Y EN FASE SÓLIDA *reconocido como GRAS (generally regarded as safe), por la United State Food and Drug Administration.

8 1.- PRIMERA ETAPA FERMENTACION EN Esta forma de cultivo se lleva a cabo en un sistema sólido o semisólido en casi ausencia de agua libre. Generalmente emplea como sustratos deshechos agrícolas disponibles. PRINCIPALES VENTAJAS simplicidad alta productividad. ESTADO SÓLIDO

9 En la primera etapa se llevara a cabo la fermentación en estado sólido del hongo Aspergillus niger ATCC:16404, evaluando la producción de lipasas en dos condiciones distintas. Como sustrato sólido se utilizara afrechillo, producto obtenido como deshecho de la industria agrícola. Por otro lado se agregaron al medio sólido aceite de oliva, como fuente adicional de carbono La elección del agregado de una fuente de carbono de origen lipídico se realizara, para determinar una posible inducción en la producción de la enzima. Las mediciones se llevaran a cabo durante las primeras 96 horas de cultivo.

10 MATERIALES Y METODOS Preparación del sustrato sólido: 1- Triturar afrechillo y colocar 2 g por tubo de ensayo. 2- Agregar: - Condición I : 2 ml de Agua pura esterilizada (3 tubos). - Condición II : 2 ml de Solución 2% de aceite de oliva (3 tubos). 3- Esterilizar en autoclave

11 Preparación del inoculo del hongo Aspergillus niger : 1- Sembrar el microorganismo en 2 cajas de Petri con Agar CYA. 2- Incubar siete días a 25 C. El Agar CYA permite un buen desarrollo del hongo, con formación de micelio. 3- Preparar una suspensión de esporas, en 10 ml de agua estéril. Esta suspensión se utilizara para inocular los tubos de ensayos con el medio de cultivo sólido. Esporas de A. niger Reservar 1 ml de la suspensión para determinar la biomasa inicial

12 Siembra del inóculo 1- Inocular cada tubo de ensayo con 200 µl de la suspensión de esporas 2- Incubaron a 25 C, hasta utilización (tiempos 48hs, 72 hs y 96 hs). Obtención de la solución con las enzimas 1- Tomar un tubo en cada tiempo y extraer la solución de enzimas con 20 ml de agua desionizada estéril. 2- Reservar 1 ml de esta solución para determinar la biomasa fúngica. 3- Filtrar la solución obtenida y centrifugar durante 15 minutos en centrifuga Rolco a velocidad máxima. 4- Filtrar nuevamente el sobrenadante y reservar la solución enzimática para los posteriores ensayos de actividad.

13 Determinación de biomasa: 1- Realizar diluciones seriadas, sobre placas con agar Czapeck Dox. 2- Incubar a 25 C, para obtener las UFC. El agar Czapeck se emplea para el recuento en placa por permitir una clara identificación de las colonias. Estas determinaciones se realizaron en el inoculo inicial y en cada uno de los tiempos fijados. Colonias de A. niger

14 Medición de actividad enzimática: Método de Lowry and Tensley Determinación colorimétrica de ácidos grasos libres. Reactivos: Enzima comercial (LIPOLASE 100 L EX de Novonordisk) Aceite Comestible Ensayos de Actividad enzimática Solución enzimática obtenida. Reactivo I: (Solución acuosa de acetato de Cu al 5% filtrado, ajustando a ph con piridina).

15 1- Agregar 0.5 ml la solución enzimática en 10 ml de aceite. Dejar actuar la enzima durante 60 minutos, a 40 C. 2- Detener la actividad enzimática (100 C, 5 min.) 3- Tomar 0.5 ml de muestra, colocar en un tubo de ensayo, agregar 5 ml de benceno, agitar hasta disolver la muestra. 4- Agregar 1 ml de reactivo I y agitar en el Vortex durante 2 minutos. 5- Centrifugar 5 minutos a velocidad Máxima en centrifuga Rolco. 6- Medir espectrofotométricamente la parte superior a 715 nm. MEDIR A 715 nm TECNICA LOWRY-TENSLEY

16 2.- SEGUNDA ETAPA FERMENTACION EN FASE LIQUIDA La fermentación se lleva a cabo a escala laboratorio. Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación.

17 En la segunda etapa se llevara a cabo la fermentación en fase liquida del hongo Aspergillus niger ATCC:16404, evaluando la producción de lipasas en dos condiciones distintas. Se preparar un medio de cultivo que contenga los nutrientes necesarios para el adecuado crecimiento del microorganismo. Por otro lado se agregaron al medio liquido aceite de oliva, como fuente adicional de carbono La elección del agregado de una fuente de carbono de origen lipídico se realizara, para determinar una posible inducción en la producción de la enzima. Las mediciones se llevaran a cabo durante las primeras 96 horas de cultivo.

18 MATERIALES Y METODOS Preparación del medio de cultivo base MEDIO MEDIO + ACEITE 1- Preparar medio de cultivo con la siguiente composición (g/l): NaH2PO4 12; KH2PO4 2; MgSO4.7 H2O 0,3; CaCl2 0,25, y sulfato de amonio al 1% como fuentes de nitrógeno. Calibrar el medio a ph:6. 2- Preparar erlenmayers con 250 ml de medio. Separar la mitad y adicionarle aceite de oliva a una concentración final de 2 % v/v. 3- Esterilizar en autoclave.

19 De esta manera se evaluara la producción de lipasas en dos condiciones: - Condición I : Medio de cultivo sin agregado de fuentes externas de carbono - Condición II : Medio de cultivo + 2% v/v de aceite de oliva Preparación del inoculo del hongo Aspergillus niger 1- Sembrar el microorganismo en 2 cajas de Petri con Agar CYA. 2- Incubar siete días a 25 C. 3- Suspender las esporas en 10 ml de agua estéril. 4- Sembrar 2,5 ml de esta suspensión en 250 ml del medio de cultivo estéril. 5- Incubar en aerobiosis, durante 48 hs a 30 C a 100 r.p.m., (etapa de adaptamiento del microorganismo en el medio de cultivo).

20 Siembra del inóculo Sembrar los erlenmayer conteniendo 500 ml de medio estéril, con 2,5 ml del inoculo. Incubar a 30 C a 100 r.p.m. Tomar muestras en cada una de las condiciones a los tiempos 24hs, 48hs, 72 hs, 96 hs. Obtención de la solución con las enzimas Tomar 10 ml del medio de cultivo a los tiempos fijados. Reservar 1 ml para realizar el recuento en placa. Centrifugar 15 min. a velocidad máxima en una centrifuga Rolco Filtrar el sobrenadante y se utilizar para los ensayos posteriores de actividad

21 Medición de actividad enzimática: Método de Lowry and Tensley Determinación colorimétrica de ácidos grasos libres Los ensayos de medición de la actividad enzimático se describen en la Etapa I. Determinación de biomasa: TECNICA LOWRY-TENSLEY 1- Realizar diluciones seriadas, sobre placas con agar Czapeck Dox. 2- Incubar a 25 C, para obtener las UFC. El agar Czapeck se emplea para el recuento en placa por permitir una clara identificación de las colonias. Estas determinaciones se realizaron en el inoculo inicial y en cada uno de los tiempos fijados.

22 3.- TERCERA ETAPA PRODUCCION DE LIPASAS EN UN FERMENTADOR. El objetivo de la tercera etapa, es evaluar el funcionamiento básico del fermentador, lograr el desarrollo de un cultivo de Aspergillus niger, en condiciones aeróbicas de crecimiento y determinar la producción de lipasas en el medio de cultivo seleccionado

23 MATERIALES Y METODOS Composición del medio de cultivo (g/l): NaH2PO4 12; KH2PO4 2; MgSO4.7 H2O 0,3; CaCl2 0,25 y como fuentes de nitrógeno y carbono sulfato de amonio al 1% y aceite de oliva al 2%. Calibrar a ph:6, para permitir optimo crecimiento del microorganismo.

24 FERMENTADOR a) Fotografía de un modelo pequeño de fermentador para investigación. Fermentador. b) Esquema de un fermentador

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