Preparación de medios de cultivo

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1 Objetivos Preparación de medios de cultivo Curso: Métodos en fitopatología 24 de abril de 2009 Dr. Pedro Mondino Conocer a que denominamos medio de cultivo en el laboratorio de Fitopatología. Reconocer la existencia de diferentes tipos de medio. Reconocer la utilidad de los diferentes medios de cultivo en el trabajo con patógenos de plantas. Objetivos El alumno debe: 1) ser capaz de elaborar medios de cultivo con el fin de ser utilizados posteriormente para el aislamiento de hongos, bacterias o microorganismos epifíticos. 2) Desenvolverse con soltura en la utilización de protocolos. Los medios de cultivo de microorganismos (hongos, bacterias, levaduras) son esenciales en el Laboratorio de Fitopatología por lo que a diario se preparan y utilizan. Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Condiciones que debe reunir un Medio de cultivo Para que los microorganismos crezcan adecuadamente, un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones: contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios disponer de oxígeno temperatura adecuada humedad ph. exento de microorganismos contaminantes. Disponibilidad de nutrientes en los. Un medio de cultivo para que permita el crecimiento adecuado de microorganismos debe contener como mínimo: Carbono Nitrógeno Azufre Fósforo Sales inorgánicas que suplan iones (K, Mg, Fe, Ca, etc.). 1

2 Disponibilidad de nutrientes en los Medios de cultivo Estos nutrientes generalmente se aportan con Extracto de malta, Peptona, Papa, extracto de levadura, etc. según su composición Medios Naturales. Consisten únicamente en un material vegetal. Ejemplos: un trozo de papa. Agar jugo de manzana, Agar durazno, Agar y jugo de vegetales. según su composición según su composición Medios definidos o sintéticos: son los medios que tienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigación. Ej: Medio Czapek. Nitrato de Sodio 2 g/l Fosfato bipotásico 1 g/l Cloruro de potasio 0,5 g/l Sulfato de magnesio heptahidratado 0,5 g/l Sulfato de hierro heptahidratado 0,01 g/l Sacarosa 30 g/l Agar-agar 15 g/l Medios complejos o de composición indefinida: Son medios cuya composición no se conoce con exactitud. contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. Ej: Agar Papa; Agar Malta; Medios complejos según su estado físico Agar Papa Dextrosa: Medio para el cultivo y conteo de levaduras y hongos en general. Agar -15g Dextrosa - 20g Infusión papa - 4g Agua destilada 1L Los medios de cultivo utilizados pueden ser de diferentes tipos: Medios sólidos. Medio semisólidos. Medios líquidos. 2

3 Medios sólidos de cultivo Usualmente para preparar un medio sólido se parte de un medio líquido al que se le añade un agente solidificante como el agar El agar es un polisacárido extraído de algas. En los medios sólidos la proporción de Agar es siempre por encima del 15% Medios semi-sólidos de cultivo El agar es el elemento solidificante más empleado en la preparación de medios de cultivo. Sus características principales son: Se licua completamente a temperaturas de ºC y se solidifica al enfriarse a 40 grados. No afecta el crecimiento de hongos ni bacterias. No es utilizado por los microorganismos que crecen en él. En los medios semi-sólidos la proporción de Agar es de alrededor del 5% Medio Agar Agua Se trata de un medio sin el agregado de nutriente alguno. Utilidad Aislamiento de hongos a partir de tejido vegetal. Se logra que el crecimiento sea el resultado de la nutrición que posee el tejido vegetal. Ensayos de evaluación de actividad antifúngica. En ocasiones se añaden al medio de cultivo sustancias indicadoras de actividades metabólicas. También se pueden añadir sustancias que ejercen acción inhibitoria selectiva de ciertos microorganismos. 3

4 La exactitud en los procedimientos de fabricación, preparación, conservación y uso, de los medios de cultivo asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos en los ensayos o experimentos. según su utilidad práctica Generales: Sirven para el cultivo de una gran variedad de microorganismos. Ej: Agar Papa destrosado (PDA); Agar Nutriente (NA) Selectivos: Son medios a los que se les agregan sustancias para inhibir el crecimiento de otros microorganismos. Ej: Agar Malta acidificado y con antibiótico para inhibir el crecimiento de bacterias. Diferenciales: según su utilidad práctica Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. según su utilidad práctica Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de un microorganismo particular o grupo de microorganismos. Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta Temperaturas de incubación En general los microorganismos patógenos de plantas crecen a temperaturas en el entorno de 24 a 28 ºC. En ocasiones incubamos a temperaturas diferentes: A 37 ºC cuando queremos descartar el crecimiento de agentes de control biológico a la temperatura del cuerpo humano. A 5ºC o menos cuando buscamos microorganismos adaptados a crecer en la cámara frigorífica. Venturia inaequalis debe incubarse a temperaturas de entre 16 y 20 ºC Condiciones adecuadas de humedad Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas de los cultivos microbianos. En las estufas de cultivo se debe proporcionar una fuente adecuada de humedad para evitar así que se deseque el medio. 4

5 Presencia de oxígeno Presencia de oxígeno Los microorganismos aerobios necesitan que el oxígeno llegue en forma adecuada al medio. En los medios líquidos se recurre a la agitación, de lo contrario solamente habrá crecimiento en la parte superior. Los microorganismos aerobios necesitan que el oxígeno llegue en forma adecuada al medio. Los anaerobios por el contrario crecen en ausencia de oxígeno. Ej. Erwinia Preparación de medio Agar Malta con antibiótico Receta del agar malta Extracto de malta 20 g/l. Agar 20 g/l ph = 5,4 Sulfato de estreptomicina al 0,02% (0,1 ml de la solución stock/100 ml de medio). Preparación de medio Agar Nutriente Receta NAD (Nutriente agar destrosa) Agar nutriente 23g Destrosa 5g Agua destilada 1000 ml. Preparación de medio Agar Nutriente Esterilidad de los 3 g de extracto de Carne de buey 5 g de peptona trípsica de gelatina 15 g de agar de cloruro sódico y glucosa agua destilada hasta 1000 ml Los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar otros microorganismos puedan interferir con el crecimiento del que queremos cultivar. Los medios de cultivo se esterilizan en el autoclave. 5

6 En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de vidrio planas Hoy existen de plástico. Procedimiento seguido para dispensar el medio en placas de Petri Los medios se pueden utilizar en frascos, placas de Petri o tubos. 6

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