FISIOLOGÍA BACTERIANA 2015 TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGIA - TÉCNICAS ASÉPTICAS - SIEMBRA Y AISLAMIENTO

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1 FISIOLOGÍA BACTERIANA TRABAJO PRÁCTICO TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGIA - TÉCNICAS ASÉPTICAS - SIEMBRA Y AISLAMIENTO OBJETIVOS: Conocer la importancia de la esterilización y familiarizarse con el manejo de los procedimientos más frecuentemente utilizados para llevarla a cabo. o Mechero Bunsen, o Horno Pasteur o estufa de aire caliente, o Autoclaves, equipos de filtración y materiales a tratar. Aprender las técnicas básicas que se utilizan para el cultivo de microorganismos. o Preparación de medios de cultivo. Uso de balanzas, medición de ph. o Técnicas de esterilización. o Trabajo en condiciones de asepsia. Preparación de placas de Petri, tubos con medio de cultivo sólido y líquido. o Técnicas de siembra en cultivo líquido y en cultivo sólido: estriamiento, punción, rastrillado, volcado. Conocer la acción de diversos antisépticos sobre la flora normal de la piel. DIA 1. A) PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACIÓN POR CALOR Preparación de medios de cultivo La preparación de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercialización de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones, siendo sólo necesaria la adición de la cantidad correcta de agua destilada para disolver sus componentes. Cuando se prepara un medio líquido se deben disolver totalmente todos sus componentes en agua destilada. A continuación el caldo se envasa en los recipientes adecuados (frascos o tubos), tapando los mismos y esterilizándolos. Siempre se debe dejar casi la mitad del volumen del recipiente vacío para ser esterilizado en autoclave. La preparación de un medio sólido puede hacerse de dos maneras: preparar el caldo disolviendo sus componentes en el volumen final de agua, pesar el agar necesario para una concentración final de 1,5% y colocar todo en una botella para esterilizar o bien utilizar un medio sólido comercial

2 (conteniendo la cantidad de agar necesaria) pesando la cantidad necesario según el fabricante y disolviendo en agua. Preparación del material para esterilizar El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado: - El material de vidrio, como tubos, frascos, erlenmeyers, etc., se cierran con tapones metálicos para evitar la entrada de los microorganismos. En el caso de las pipetas, se introducen en estuches o cajas metálicas para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio vacío se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur. En caso de que los frascos o tubos posean tapas de plástico se esterilizan en autoclave. - El material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para su uso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se esterilizan con óxido de etileno o radiaciones. - Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en frascos o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave. Las tapas de los frascos y tubos deben permitir el intercambio de vapor (no deben estar ajustadas herméticamente), y al igual que los tapones de algodón, deben recubrirse con papel. Existen varios métodos para llevar a cabo el proceso de esterilización y la elección de uno determinado viene condicionada por el tipo de material que se quiere esterilizar. Ejercicio 1: Preparación y esterilización de materiales en el autoclave. MATERIALES: - Espátulas, balanza, agua destilada, probetas ( ml), frascos, medios de cultivo. Los alumnos preparan y acondicionan (por comisión) para esterilizar en autoclave: LB-Agar: 1 litro LB-Caldo: 300 ml LB-semisólido: 250 ml Agar Mac Conkey: 200 ml Agua en frascos: 3 frascos con 50 ml c/u. PROTOCOLO DE MANEJO Y ESTERILIZACIÓN EN AUTOCLAVE MANUAL: 1. Asegurarse de que haya un buen nivel de agua destilada en la autoclave. Si no hay suficiente, agregarla hasta que casi llegue a la parrilla inferior. 2. Introducir el material que se va a esterilizar procurando que quede bien ubicado para evitar derrames y cerrar la puerta ajustándola bien. Debe quedar herméticamente cerrado. 3. Abrir la válvula de salida de vapor y encender la fuente de calor del autoclave.

3 4. A medida que suba la temperatura del agua (ver el termómetro), empezará a salir una mezcla de vapor-aire por la válvula de salida de vapor. Dejar que escape esta mezcla hasta que solo salga un flujo continuo de vapor y el aire haya sido eliminado; a esto se le llama purgar el autoclave. 5. Una vez purgado el autoclave, cerrar la válvula de salida de vapor y dejar que la presión suba hasta 15 libras por pulgada cuadrada, (1 atmósfera, vigilar el manómetro), lo que proporciona una temperatura de 121 C. Observar que no es la presión del autoclave lo que mata a los microorganismos sino la elevada temperatura que puede alcanzarse cuando el vapor de agua se somete a presión. 6. En ese momento empezar a contar el tiempo. 7. Transcurridos 15 minutos a 15 libras de presión, apagar la fuente de calor y dejar que el autoclave se enfríe sólo. 8. Esperar a que la presión baje a 0 libras y luego abrir la válvula de salida de vapor. Abrir el autoclave y sacar el material. Los autoclaves automáticos son eléctricos, los parámetros se seleccionan al inicio y el equipo controla la salida de vapor y el tiempo de esterilización a la temperatura fijada. B) MANEJO DE MATERIAL EN EL LABORATORIO. TÉCNICAS ASÉPTICAS, MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO. Trabajo en condiciones de asepsia. Preparación de placas de Petri y tubos con medios de cultivo sólido o líquido. Técnicas de siembra en cultivo líquido y en cultivo sólido: estriado, punción, rastrillado, volcado. Ejercicio 2: Práctica de pipeteo, trasvasado de soluciones y manipulación en condiciones de esterilidad. MATERIALES: - Ansa, hilo, gradilla y mechero - Espátula de Drigalsky - Pipeteros con pipetas de 5 ml - Tubos de ensayo - Frascos con ependorf esteriles - Micropipetas automaticas - Caja con puntas de micropitetas (amarillas y azules) - Agar Nutritivo (o medio LB) fundido TECNICA 1- Se practicarán las técnicas de manipulación en condiciones de esterilidad (pipetas de vidrio, pipetas automáticas, ansas, trasvasado de líquidos, toma de muestras, etc.).

4 2- Armado de placas con medio sólido LB o Agar Nutritivo. Cada alumno prepara dos placas y cada grupo prepara una placa más, manteniendo las condiciones de esterilidad. Dejar solidificar y secar las placas. (Se reservan para utilizar utilizarán en los ejercicios 3, 4 y 5). 3- Armado de tubos en pico de flauta con agar nutritivo (2 ml), 1 por alumno. 4- Armado de tubos en columna con agar nutritivo semisólido (2 ml), 1 por alumno. Ejercicio 3: Siembra y aislamiento de distintas muestras bacterianas. MATERIALES - Placas con agar nutritivo o LB (preparadas). Una por alumno y una por grupo. - Tubos en columna y pico de flauta. Uno por alumno. - Ansa, hilo, estufa, mecheros. Siembra y aislamiento. Se tomará una muestra de E. coli o B. subtilis (o de una mezcla de ambas), para realizar las siembras como se detalla a continuación. TECNICAs Procedimiento para obtener colonias aisladas estriando en placa: a) Flamear el ansa y enfriar manteniendo esterilidad. b) Obtener un inóculo con ella (en forma estéril). c) Estriar con el ansa el medio estéril contenido en una placa de Petri siguiendo uno de los modelos mostrados en la guía. d) Flamear el ansa al terminar de sembrar. Siembra en agar inclinado (pico de flauta) por estría: a) Flamear el ansa y enfriar manteniendo esterilidad. b) Obtener material a sembrar. c) Apoyar el ansa sobre la superficie del agar y estriar en zig-zag. d) Flamear el ansa. e) Alternativamente, sembrar con hilo haciendo una punción y estriado en superficie. Inoculación por punción: a) Flamear un hilo (ansa recta). b) Una vez frío, sumergir en una suspensión bacteriana. c) Punzar cuidadosamente en el centro del tubo sin llegar al fondo y retirar el hilo cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino de la punción. d) Flamear el hilo.

5 C) USO DE DESINFECTANTES Ejercicio 4. Comparar la efectividad de antisépticos y desinfectantes. MATERIALES - Agua oxigenada/ Tintura de yodo al 1%/ Alcohol al 96%/Agua y jabón - Solución salina isotónica estéril (NaCl 0.85%) o agua estéril. - Hisopos estériles, 2 por alumno. - Agua estéril. - 1 Placa de Petri con agar nutritivo por alumno (preparada en el ejercicio 2). - Mecheros - Estufa de 37 C. TECNICA Analizar la presencia de microorganismos en diferentes superficies del laboratorio y sobre la piel u otras superficies, antes y después de ser tratadas con antisépticos o desinfectantes, según corresponda: 1. Tomar la placa de agar nutritivo preparada en el ejercicio 2 y dividirla al medio (o en cuatro) con marcador y rotular cada mitad: antes del tratamiento, después del tratamiento. 2. Tomar muestras de la superficie elegida con un hisopo y sembrar en la mitad de la placa de agar nutritivo. Si la superficie está seca, humedecer previamente el hisopo en agua estéril. 3. Aplicar el antiséptico o desinfectante sobre la misma superficie. 4. Tomar nuevamente una muestra con otro hisopo y sembrar en la otra mitad de la placa de agar nutritivo. 5. Incubar durante la noche a 30 C en estufa. 6. Analizar los resultados. Comparar los resultados con los demás compañeros y hacer una tabla indicando el antiséptico empleado y el número de colonias en donde hubo crecimiento. D) EFECTO DE LA RACIACIÓN UV Ejercicio 5. Evidenciar la acción antimicrobiana de la radiación UV. MATERIALES - Placa de agar nutritivo (preparada en el ejercicio 2) - Ansa, mechero - Cepas: Escherichia coli DH5, E. coli MC4100, Serratia marcescens TÉCNICA 1- En una placa de agar nutritivo (preparada en el ejercicio 2) hacer una estría con cada una de tres cepas bacterianas (por grupo): (1) E. coli DH5α, (2) E. coli MC4100, y (3) S. marcescens. 2- Con la placa protegida de la luz UV, destapar para exponer a la radiación tres regiones durante:

6 a) 0min, b) 1 min y c)3 min. 3- Luego, incubar en estufa a 30 ºC durante toda la noche. DIA 2. A) Análisis de los resultados del día anterior: Ej. 3: Observar la calidad del aislamiento en placa obtenido por la técnica de depósito y posterior quemado utilizada. Observar colonias aisladas. Observar el crecimiento en los tubos con pico de flauta. Observar el crecimiento en columna semisólida. Ej. 4: Comparar los resultados con los demás compañeros y hacer una tabla indicando el antiséptico empleado y el número de colonias en donde hubo crecimiento. Ej. 5: Analizar la acción antimicrobiana de la radiación UV. B) Armado de la Columna de Winogradsky.

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