PROCEDIMIENTO RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS NORMA ISO OBJETIVO Conocer el número de Mohos y Levaduras que contiene un alimento.

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1 PRT Página 1 de OBJETIVO Conocer el número de Mohos y Levaduras que contiene un alimento. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Este procedimiento se aplica a todos los alimentos de consumos humano o animal en los cuales el ambiente es menos favorable para el crecimiento bacteriano por ej ph <5, baja humedad, aw (0.75), alto contenido en sal o azúcar, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos o exposiciones a irradiación. 3. FUNDAMENTO Los hongos son generalmente aerobios estrictos, en cambio las levaduras pueden crecer con o sin oxígeno; en presencia de éste crecen mejor. Las levaduras crecen más rápido que los hongos. Existen varios medios de cultivo recomendados para alimentos, para reducir el crecimiento bacteriano, algunos utilizan valores de ph bajos ( 4), otros la adición de antibióticos como por ejemplo penicilina + estreptomicina, cloramfenicol, clortetraciclina, oxytetraciclina o gentamicina. 4. REFERENCIAS 4.1 Norma ISO Microbiology- General Guidance for enumeration of yeasts and moulds- Colony count technique al 25 C. First edition 1987.

2 PRT Página 2 de TERMINOLOGÍA 5.1 No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES Tubos 16x160 mm Placas de Petri Pipetas bacteriológicas de 1 ml 6.2 EQUIPOS Baño de agua termorregulado a 47 C ± 2 º C para mantener el agar fundido Estufa de incubación regulada entre el rango de 22 C a 25º C (24 C ± 1 C) Cuenta colonias modelo Quebec 6.3 MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVOS Agar Cloranfenicol- dextrosa- extracto de levadura (cloranfenicol puede ser reemplazado por oxitetraciclina) Solución de Cloranfenicol u Oxitetraciclina al 0,1% Agua de dilución: Solución de agua peptonada al 0,1 % o Agua buffer fosfato Reactivos Tinción de Gram o Reactivos para Tinción Simple. 7. DESARROLLO 7.1 SIEMBRA Preparar la muestra por uno de los métodos recomendados en el PRT Pipetear por duplicado a placas Petri estériles alícuotas de 1 ml de la muestra si es producto líquido o 1 ml de la dilución 10-1 en el caso de otros productos Sembrar por lo menos dos diluciones consecutivas por duplicado.

3 PRT Página 3 de Se recomienda esta serie de diluciones cuando no se conoce el rango aproximado de microorganismos Agregar 15 ml de agar fundido y temperado a 47ºC ± 2ºC El tiempo transcurrido entre la preparación de la suspensión inicial y el momento de agregar el agar no debe exceder de los 15 min Mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operación sería la siguiente: Mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección, hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj, mover con movimientos de vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la primera y hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj Una vez solidificado el agar, NO INVERTIR las placas Incubar a 22-25ºC durante 3 a 5 días Realizar controles de ambiente, medio de cultivo y diluyente. Anotar resultados en registros código RG LECTURA Tomar todas las precauciones necesarias al manipular las placas Petri, para evitar la contaminación del área de trabajo. Las esporas de los mohos se dispersan con gran facilidad Usar un cuenta colonias y contar las placas que contengan menos de 150 colonias Si parte de la placa presenta desarrollo excesivo de hongos, o si es difícil contar colonias aisladas en menos tiempo, registrar los recuentos obtenidos y registrar el período de incubación, ya sea tres o cuatro días e incluirlo en el informe final. No contar las placas antes de 3 días de incubación, la manipulación podría provocar colonias secundarias por dispersión de esporas Contar las colonias de mohos las que se presentan bajo una forma filamentosa característica (micelio) de color variable. Estas se desarrollan más tardíamente que las levaduras. Anotar resultados en RG

4 PRT Página 4 de Contar las colonias de levadura por separado. Las colonias de levaduras se presentan en forma de colonias opacas, blancas o amarillas. Anotar resultados en RG Realizar Tinción de Gram según IT o microscopía al fresco (IT ) a las colonias sospechosas de levaduras para confirmar su presencia. Anotar el resultado en el registro código RG CALCULO El número de Mohos y Levaduras por gramo o ml de alimento se determina según la siguiente fórmula : N = Σ C [ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d donde : N = número de colonias por ml o g de producto Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas n1 = número de placas contadas de la menor dilución. n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva. d = dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento

5 PRT Página 5 de EXPRESION DE RESULTADOS Se informa Recuento de Mohos por gramo o ml de alimento y Recuento de Levaduras por gramo o ml de alimento Aproximar el resultado a dos cifras significativas. Si el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9 adicionar una unidad al segundo dígito. Si el tercer dígito es 1, 2, 3 o 4 considerar solamente los dos primeros dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una unidad al segundo dígito si este es impar y mantener el segundo dígito si este es par. Usar ceros para los demás dígitos hacia la derecha i todas las placas de ambas diluciones no presentan crecimiento o desarrollo, informar como menor de uno por el valor recíproco de la dilución menor por g o ml. < 1 x 1/ d m, donde d m = menor dilución 8. REGISTROS Identificación del registro Registro control de ambiente, RG Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis Laboratorio 346, RG Registro análisis de muestras de alimentos y agua Laboratorio de Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición Archivador verde Acceso Papel 5 años y Registros restringido a disposición en Laboratorio N 346 personal basura normal Sección Sección partidos en trozos. Microbiología Microbiología. y Agua. Archivador verde Registros Laboratorio N 346 Sección Microbiología y Agua. Archivador Registros Lecturas e informes de resultados Acceso restringido personal Sección Microbiología. azul Acceso de restringido personal Sección Papel 5 años y a disposición en basura normal partidos en trozos. Papel 5 años y a disposición en basura normal partidos en trozos.

6 PRT Página 6 de 14 Identificación del registro Recuentos RG Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición Laboratorio Microbiología. Recuento aerobios mesófilos, S.aureus, Mohos y levaduras Sección Microbiología y Agua. 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Motivo del cambio Modificada 1 1 Se elimina página 1 por cambio en formato documento institucional. 1 1 Se cambió formato del encabezado de página en todo el documento. Fecha Aprobación Se corrige PRT por PRT Se cambió número de revisión por 1 por revisión N 2 y el total de páginas. 1 2 En el punto 2.0 se eliminó el último párrafo. 1 2 Se deja pie de página sólo en página 1 y se actualizan los cargos. 1 2 Se eliminó el último párrafo del punto Se cambia referencia 4.1 Standard Methods for examination of Dairy products por: Norma ISO 7954 Microbiology- General guidance for enumeration of yeasts and moulds- Colony count technique al 25 C. First

7 PRT Página 7 de 14 Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio edition Fecha Aprobación Se eliminan las referencias 4.2 al Se cambian los puntos y por: Tubos 16x160 mm y por Placas de Petri respectivamente. 1 3 En el punto se cambia:...50 C...por: C ± 2 º C En el punto se agrega:... entre el rango de 22 C a 25º C ( 24 C ± 1 C). 1 3 El punto se cambió Agar Oxitetraciclina Extracto de levadura Glucosa-Agar (OGY) (ICMSF) por: Agar Cloranfenicol- dextrosa- extracto de levadura (cloranfenicol puede ser reemplazado por oxitetraciclina). 1 3 En el punto se remplazó la frase por: Solución de Cloranfenicol u Oxitetraciclina al 0,1%. 1 3 En el punto se reemplazó la frase por: Agua de dilución: Solución de agua peptonada al 0,1 % o Agua buffer fosfato. Se agregó el punto se incluyó:... o Reactivos para Tinción Simple. 1 3 En el punto se cambió por: PRT En el punto se agregó:... de la muestra si es producto líquido o 1 ml de la dilución 10-1 en el caso de otros productos. 1 3 Se cambió punto por: Sembrar por lo menos de diluciones consecutivas por duplicado.

8 PRT Página 8 de 14 Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio Se trasladan de posición los números correlativos. 1 3 En el punto se cambió...10 ml por 15 ml y 50 C ± 1 C por 47ºC ± 2ºC 1 3 En el punto se cambió las viñetas de letras a,b,c,d por los números: al Se incluyó el punto al En el punto se cambió entre por:... menos de Se agregó un punto, cambiando el punto por: Si parte de la placa presenta desarrollo excesivo de hongos, o si es difícil contar colonias aisladas en menos tiempo, registrar los recuentos obtenidos y registrar el período de incubación, ya sea tres o cuatro días e incluirlo en el informe final. Fecha Aprobación Se cambian de posición los números correlativos. 1 4 En el punto se cambió RG , por: RG En el punto en el párrafo después del punto a parte, se cambió RG por : RG En el punto se cambió IT por: IT , RG por : RG Se asigna el punto y se agregaron los puntos y En el punto 8.0 RESPONSABLES se cambió por REGISTROS y sus ítemes. Se incluyó tabla de registros. 1 5 Se eliminaron los ítemes de responsables.

9 PRT Página 9 de 14 Revisión Nº Pág. Motivo del cambio Modificada 1 5 El punto 9.0 Distribución se cambió por: TABLA DE MODIFICCAIONES. 1 5 Se agregó el punto 10. ANEXOS y sus ítemes. Fecha Aprobación 1 9 Al título se le agregó la palabra CLORANFENICOL 1 9 A la fórmula se le agregó la explicación del asterisco( *) 1 9 Se agregaron 2 puntos en la preparación del medio. 10. ANEXOS 10.1 Anexo N 1 Recuento Mohos y levaduras, Técnica recuento en placa por siembra en profundidad Anexo N 2 Generalidades Anexo N 3 Agar cloranfenicol (oxitetraciclina)-extracto de Levadura- Dextrosa Anexo N 4 Hoja registro de resultados de análisis RAM, S.aureus, Mohos y Levaduras en muestras de alimentos y agua.

10 PRT Página 10 de 14 ANEXO Nº 1 RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS TECNICA RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD HOMOGENEIZADO: 1 ml 10 g muestra 9 ml AP 90 ml Agua peptonada 0.1% Dil SIEMBRA : 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Agar OGY INCUBACION: ºC placas no invertidas por 5 días LECTURA PLACAS : Lectura de placas que contengan entre 10 a 150 ufc Colonias levaduras Colonia mohos, (micelio) CONFIRMACION : Tinción de Gram Formas alargadas o cocáceas Gram positivas CÁLCULO RTO LEVADURAS: Hacer el cálculo según Nº de colonias confirmadas por Gram, por la dilución CALCULO RTO MOHOS: Hacer el cálculo según Nº de colonias contadas por la dilución INFORME Informar como Nº de UFC mohos/g o ml de producto Informar como Nº de UFC levaduras/g o ml de producto

11 PRT Página 11 de 14 ANEXO Nº 2 GENERALIDADES Los hongos y levaduras son fácilmente encontrados en alimentos en los cuales el ambiente es menos favorable para el crecimiento bacteriano por ej bajo ph 5 o <5, baja humedad, aw (0.75), alto contenido en sal o azúcar, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de de antibióticos o exposiciones a irradiación. Causan deterioro de estos alimentos si son almacenados en condiciones deficientes, como por ejemplo (frutas frescas, jugos de fruta, vegetales, quesos, cereales, picles y alimentos deshidratados o congelados, decoloración de las superficies de los alimentos, olores y sabores extraños. Habría que sumar al deterioro, el peligro potencial de producción de micotoxinas, producidas por algunas especies de hongos. Si estas sustancias son ingeridas causan intoxicación alimentaria. Para eliminar o reducir tales problemas en los alimentos susceptibles se debería: a) Reducir la carga de esporas con buenas prácticas de higiene. b) Consumo rápido de los alimentos preparados c) Guardar los alimentos congelados a-12 ºC d) Eliminar o reducir el contacto con el aire e) Calentar los alimentos antes de envasarlos para destruir células vegetativas y esporas. f) Agregar ácidos que eviten el crecimiento. g) Agregar preservantes químicos, tales como sorbatos o benzoatos. Ningún ser humano ni animal puede consumir alimentos que estén visiblemente contaminados por hongos, excepto los alimentos fabricados con algunas especies de hongos que le dan su sabor característico, como por ejemplo queso roquefort, cammembert o ciertos salames. Las levaduras crecen más rápido que los hongos, pero generalmente crecen en conjunto. Los hongos son generalmente aerobios estrictos, en cambio las levaduras pueden crecer con o sin oxígeno; en presencia de éste crecen mejor. En alimentos frescos y congelados, el encontrar un número bajo de esporas de hongos y levaduras es poco significativo; pero si el alimento está altamente contaminado su consumo puede resultar peligroso.

12 PRT Página 12 de 14 Existen varios medios de cultivo recomendados para alimentos, para reducir el crecimiento bacteriano, algunos utilizan valores de ph bajos ( 4), otros la adición de antibióticos como por ejemplo penicilina + estreptomicina, cloramfenicol, clortetraciclina, oxytetraciclina o gentamicina. La Gentamicina se recomienda para controlar el crecimiento de bacterias Gram negativas y es bastante efectiva en productos cárneos enfriados. El agar Rosa de Bengala retarda el crecimiento de hongos que normalmente forman abundante micelio aéreo, tales como Neurospora y Rhizopus y es inhibitorio para algunas levaduras. Se recomienda usar preferentemente el agar con antibiótico ya que su selectividad y especificidad son superiores a las del agar acidificado. En cuanto a la temperatura de incubación la recomendada por dar mejor resultado es de 22ºC por 5 días.

13 PRT Página 13 de 14 ANEXO Nº 3 AGAR CLORANFENICOL (OXITETRACICLINA)-EXTRACTO DE LEVADURA-GLUCOSA Fórmula Extracto de levadura 5 g Glucosa 20 g Cloranfenicol 0,1 g* Agar 20 g Agua destilada 1000 ml * obtener una concentración final de 100µg / ml de medio. Pesar según lo indica el fabricante y adicionar 1 L de agua destilada. Calentar ligeramente para su completa disolución Enfriar y medir el ph del, medio de cultivo 6,6 ±0,2 con electrodo de contacto. Dispensar 100 ml en frasco con tapa rosca. Esterilizar en autoclave a 121 ºC por 15 minutos. Si reemplaza el cloranfenicol por oxitetraciclina, debe preparar el medio como se indica arriba, pero omita el cloranfenicol. Dispensar en cantidades de 100 ml y esterilice. Preparar a parte la oxitetraciclina al 0,1 % (m/m) en agua destilada y esterilice por filtración. Justo antes de usar el medio añada 10 ml de la solución a 100 ml del medio base el que ha sido mantenido fundido a 47 C± 2 C. Después de la adición del antibiótico, no debe someterse el medio a altas temperaturas.

14 PRT Página 14 de 14 SOLUCION DE OXITETRACICLINA Disolver 0,1 g de oxitetraciclina en 100 ml de agua destilada. Esterilizar por filtración. Esta solución se puede refrigerar hasta 5 días. En el momento de usar, añadir 10 ml de solución de oxitetraciclina al 0,1% por 100 ml de agar previamente licuado y enfriado a 50ºC.