PROCEDIMIENTO RECUENTO DE MICROORGANISMOS HETEROTROFOS EN PLACA. METODO STANDARD METHODS FOR EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER

Transcripción

1 PRT Página 1 de OBJETIVO Conocer el número de microorganismos heterotróficos viables que contiene una muestra de agua de diálisis para verificar la calidad bacteriológica especificada en el Decreto Supremo Nº 2357/94 del MINSAL. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a todas las aguas de diálisis que sean recepcionadas para análisis microbiológico. 3. FUNDAMENTO Este es un método de recuento en placa y siembra en profundidad. Los resultados de este análisis permiten: Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección. Determinar el origen de la contaminación durante el proceso de diálisis. Verificar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte del agua utilizada para alimentar el sistema de diálisis. El Decreto Supremo Nº 2357/94 especifica que la calidad bacteriológica del agua a usar en diálisis " cada centro de diálisis debe realizar un cultivo semestral del agua teniendo como recuentos máximos aceptables 200 UFC/mL en agua tratada y 2000 UFC/mL del líquido de diálisis post dializador. 4. REFERENCIAS 4.1 Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 21th Ed 2005 pag a 9-38.

2 PRT Página 2 de TERMINOLOGÍA 5.1 Heterotroficos: Organismos que se alimentan de sustancias orgánicas. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES Y EQUIPOS Placas Petri estériles de vidrio o de plástico de mm de diámetro Tubos de 16 x 160 mm marcados en 9 y 10 ml, que contengan 9 ml de solución diluyente estéril Pipetas bacteriológicas estériles de 1 ml Incubadora regulada a 25 ± 1 C (rango 20 C a 28 C) o incubadora a 35 C ± 1 C) Baño de agua termorregulado a 47 ºC ± 2 º C Agitador de tubos Contador de colonias, tipo Quebec de campo oscuro o equivalente. 6.2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS AGUA RECOMENDADA PARA USO EN MICROBIOLOGIA Para preparar medios de cultivo, reactivos y blancos de dilución sólo se debe usar agua que ha sido tratada por desionizador, para dejar libre de trazas de metales disueltos y componentes bactericidas e inhibitorios DILUYENTE: Agua peptonada estéril 0.1 %, (Straka and Stokes, 1957) ph 7± 0.1 o agua buffer fosfato, distribuida en volúmenes de 9 ± 0,2 ml en tubo tapa rosca marcado en 9 y 10 ml o en frascos con 99 ± 2 ml AGAR PARA RECUENTO EN PLACA: Es recomendable usar un agar pobre en nutrientes como el agar R2A ph 7.2 con el cual se obtienen recuentos mas altos que con agar Plate Count. En caso de no contar con este agar se puede usar Agar Plate Count Agar o Standard Methods Agar estéril, ph 7±0.1, distribuido en frasco Schott con 200 ml. La formulación de Merck código es idéntica a la descrita en Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 21 th Ed (Fórmula agar R2A: extracto de levadura 0,5 g, proteosa peptona 0,5 g, casamino ácido 0,5 g, glucosa 0,5 g, almidón soluble 0,5 g, dipotasio hidrógeno fosfato 0,3 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, piruvato de sodio 0,3 g, agar 15 g, agua 1 L ph 7.2, esterilizar a 121 ºC por 15 minutos).

3 PRT Página 3 de DESARROLLO 7.1 PROCEDIMIENTO Recibir en el Laboratorio de Recuentos, las muestras enumeradas en el Laboratorio de Recepción de Muestras de esta sección. Estas muestras son procesadas según el PRT de "Procedimiento de Recepción de las muestras" y el PRT de "Procedimiento de procesamiento de muestras de alimentos y agua" Anotar en cuaderno de inscripción, la clave y número de las muestras a sembrar Verificar que el volumen de cada tubo de dilución marcado, contengan 9 ml Preparar diluciones decimales de 10 1, 10 ², 10 ³, etc. a partir de la muestra líquida directa. Para ello transferir 1 ml a un tubo con 9 ml de diluyente o 1 ml en 99 ml de diluyente ( dil 10 ²).Agitar y proceder de igual forma para las diluciones siguientes Identificar las placas Petri con lápiz azul las que se incubarán a temperatura entre el rango 20 ºC y 28 C. Colocar clave, número de la muestra y dilución a cada una de ellas Sembrar 1 ml por duplicado de la muestra directa y cada dilución en placas estériles previamente identificadas. Sembrar como mínimo dos diluciones consecutivas También se pude sembrar 1 ml en duplicado de la muestra directa y 0,1 ml en duplicado de la muestra directa. A continuación diluir 10 ² tomando 1 ml de la muestra directa en 99 ml de diluyente y sembrar de esta dilución 1 ml en duplicado y 0,1 ml en duplicado.sembrar como mínimo 2 diluciones consecutivas Verter en cada placa Petri aproximadamente 15 ml de agar previamente fundido y mantenido en baño de agua a 47 ± 2 ºC Mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operación sería la siguiente: Mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección, hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj, mover con movimientos de vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la primera y hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj Una vez solidificado el agar, invertir las placas rápidamente para prevenir el crecimiento de colonias invasivas por acumulación de humedad. Incubar a temperatura entre el rango de 20ºC a 28 C durante 6 días ± 1 día.

4 PRT Página 4 de Con el fin de validar los resultados se recomienda realizar controles de ambiente, control de esterilidad del medio de cultivo y diluyente y registrar esta información en los registros respectivos. 7.2 LECTURA Luego de cumplir el período de incubación, realizar la lectura de las placas Si no es posible leerlas prontamente, guardarlas a 4ºC por no más de 24 horas, pero esto no hay que hacerlo de rutina Realizar el recuento con un contador de colonias modelo Quebec de campo oscuro Examinar las muestras dudosas con mayor aumento para distinguir las colonias de materias extrañas Evitar la fatiga ocular que puede causar imprecisiones Anotar la dilución usada y el número de colonias contadas en cada placa Registrar los resultados en el registro RG y los controles realizados en los registros especificados en el punto 8. de este procedimiento 7.3 RECUENTO DE COLONIAS Y REGISTRO Para el recuento de heterótrofos se sugiere indicar el método usado, tiempo y temperatura de incubación y el medio de cultivo seleccionado. Para el cálculo de recuento de colonias en placa se realiza de acuerdo al siguiente esquema: Placas normales ( colonias): Seleccionar las placas libres de crecimiento invasivo Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamaño muy pequeño Anotar por dilución, el número de colonias contadas en cada placa Realizar el cálculo para recuento de microorganismos heterótrofos en placa, dividiendo el número total de colonias por placa por el volumen de muestra o calcular el promedio (duplicado de palcas de la misma dilución) multiplicado por el factor de dilución correspondiente.

5 PRT Página 5 de Casos especiales Si no se tienen placas que cumplan con el requisito anterior, proceder de la siguiente manera: Placas sobrepobladas (mas de 300 colonias) : Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosos para contar (MNPC) cuando disponga de placas normales Si no dispone de placas normales en las diluciones sembradas, contar las colonias en porciones de la placa si su distribución es homogénea y calcular el recuento estimado en placa (RPES) como sigue: Si hay menos de 10 colonias por cm², contar las colonias en 13 cuadrados, seleccionar 7 cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados consecutivos verticales formando ángulo recto, contar cada cuadrado sólo una vez.la suma de las colonias de los 13 cuadrados multiplicar por 5 para calcular el número de colonias por placa correspondiente a un área de 65 cm 2 o bien calcular el promedio de los 13 cuadrados y multiplicar por 65, multiplicar el valor final por el factor de dilución respectivo. Para placas de área 57 cm 2 calcular el promedio, multiplicar por 57 y por el factor de dilución respectivo Si hay más de 10 colonias por cm² contar las colonias en cuatro de tales porciones. En ambos casos, multiplicar el número promedio de las colonias contadas por cm² por el área de la placa usada para estimar el número de colonias por placa. Cada laboratorio debe determinar el área en cm² de las placas usadas Si hay mas de 100 colonias por cm², registrar como >100 ufc / cm² y calcule el valor estimado multiplicado por el factor de dilución respectivo y por el área correspondiente a la placa utilizada o bien calcule el valor estimado como > 100 ufc/ cm² multiplicado por el área correspondiente a la placa utilizada y divida por el volumen menor de muestra sembrada Placas con menos de 30 colonias (< 30 colonias) Cuando el número de colonias desarrollado en 2,0 ml es inferior a 30 registre el resultado observado e informe como recuento en placa estimado (RPES) < 30 ufc/ ml. Si fuese necesario realizar el cálculo, promediar el recuento de la misma

6 PRT Página 6 de 15 dilución de las placas en duplicado e informar como recuento en placa estimado (RPES) Placas sin desarrollo de colonias Cuando ninguna de las placas presente desarrollo de colonias, registrar como sin desarrollo en la dilución correspondiente (SD) e informar como < 1 ufc /ml Crecimiento invasivo Las colonias invasivas son generalmente de tres tipos: El primer tipo son las colonias en cadenas, que al parecer son causadas por desintegración de un grupo de bacterias cuando la placa Petri es rotada para mezclar el agar con la alícuota analizada. Si solamente existe una de tales cadenas contar como una colonia. Si una o mas cadenas parecieran originarse de fuentes distintas, contar cada fuente como una colonia. No contar cada crecimiento individual de tal cadena como una colonia El segundo tipo de colonia invasora es la que se desarrolla en una película de agua entre el agar y el fondo de la placa Petri El tercer tipo es la que se forma en una película de agua en el costado o en la superficie del agar Estos dos últimos tipos revelan una acumulación de humedad en el punto en el cual se origina el crecimiento invasivo. Cuando la alícuota de siembra es uniformemente distribuída en el medio, las bacterias raramente desarrollan colonias invasivas Si en las placas seleccionadas se presenta invasión, realizar recuento de colonias solamente: Si el área invadida no excede la mitad de la placa Si las colonias están bien distribuidas fuera del área invadida Si no se cumple lo anterior, registrar como crecimiento invasivo o accidente de laboratorio Los laboratorios con un 5 % de placas cubiertas con más de 1/4 de las placas con crecimiento invasivo, deberían tomar medidas inmediatas, para eliminar este problema (reducir la humedad ambiente en la cámara o estufa de incubación y mezclar cuidadosamente el agar con la siembra).

7 PRT Página 7 de Accidente de laboratorio o inhibidores de crecimiento bacteriano: Cuando una placa presenta contaminación u otra condición insatisfactoria registrar como "Accidente de Laboratorio". Especificar El analista puede sospechar la presencia de sustancias inhibidoras en las muestras que están siendo analizadas, cuando las placas no tienen crecimiento o tienen proporcionalmente menos crecimiento en las diluciones mas bajas. Tal resultado no debería ser interpretado como evidencia de inhibidores hasta confirmar la presencia de ellos en el producto. 7.4 EXPRESION DE RESULTADOS Cálculo y registro de resultados Para los cálculos del Recuento Standard en placa considerar sólo los dos primeros dígitos Si el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9 adicionar una unidad al segundo dígito. Si el tercer dígito es 1, 2, 3 o 4 considerar solamente los dos primeros dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una unidad al segundo dígito si este es impar y mantener el segundo dígito si este es par Usar ceros para los demás dígitos hacia la derecha. Ejemplo: Lectura calculada Rto Heterotroficos Placas normales Cuando los recuentos de los duplicados de placas de sólo una de las diluciones caen dentro del rango 30 a 300 colonias : Utilizar para el cálculo los recuentos obtenidos en placas normales Sacar promedio y multiplicar por el factor de dilución.

8 PRT Página 8 de Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango colonias calcular el RAM según la siguiente fórmula: N = Σ C [ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d donde : N = número de colonias por ml o g de producto Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas n1 = número de placas contadas de la menor dilucion. n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva. d = dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento Ejemplo 1 : : y y 28 N = [( 1 x 2 )+( 0.1 x 2 )] x 0,01 = = = Cuando los recuentos de las placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del rango colonias, usar sólo aquellos recuentos que estén dentro de este rango.

9 PRT Página 9 de Todas las placas con menos de 30 colonias Cuando las placas de ambas diluciones tienen menos de 30 colonias cada una, informar el recuento como menor de 30 por el recíproco del factor de dilución menor. Ejemplo 1 : : Rto ( ml o g ) 18 2 < < Todas las placas con mas de 300 colonias Cuando las placas de ambas diluciones tienen más de 300 colonias cada una (pero menos de 100 por cm²) contar las placas más cercanas a 300, sacar promedio y multiplicar por el recíproco de la dilución. Ejemplo 1 :100 1 : Rto ( ml o g ) MNPC estimado ( RPES ) ( MNPC = Muy numeroso para contar ) Todas las placas con mas de 100 colonias promedio por cm² Estimar que el Rto es mayor de 100 veces la mayor dilución sembrada, por el área de placa utilizada y por el recíproco de la dilución. Ejemplo 1 : : R A M ( ml o g ) TNPC 7.150* > * ( RPES ) TNPC 6.490** > **( RPES ) * basado en un área de placa de 65 cm² ( 9 cm Ø ) ** basado en un área de placa de 57 cm² ( 8,5 cm Ø )

10 PRT Página 10 de Todas las placas con crecimiento invasivo, presencia de inhibidores o accidente de laboratorio Informar según corresponda. 7.5 INFORME DE RESULTADOS Informar el recuento de heterotróficos en unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro (UFC/mL) Expresar el Resultado con sólo un número entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la potencia correspondiente. Ej ,4 x 10 3 UFC/mL. 7.6 REPRODUCIBILIDAD Y ERROR PERSONAL El resultado obtenido al contar por segunda vez las colonias de una placa determinada debe presentar: Una diferencia máxima del 5% en el caso de que este recuento lo realice la misma persona Una diferencia máxima del 10% en el caso de que este recuento lo haya realizado otra u otras personas Cuando la diferencia entre ambos es superior a estos límites, puede deberse a defectos visuales, a la dificultad de reconocer las colonias muy pequeñas o lo que es mas frecuente, a la incapacidad para diferenciar las colonias de las partículas más pequeñas. 7.7 CONTROLES Chequear esterilidad de: Agua de dilución Agar para recuento en placa ( Plate Count o agar Standard Methods) Pipetas Placas Petri

11 PRT Página 11 de Control de ambiente por método de sedimentación en placa: Mesón de siembra Flujo laminar Control de temperatura Control de temperatura de incubadora diariamente a 1ª hora de la mañana y a última hora en la tarde Control de temperatura del baño termorregulado para mantener agar cada día que se siembren muestras. 8. REGISTROS Identificación Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo del registro retención y disposición Registro control Archivador verde Acceso Papel 5 años y ambiente código Registros Laboratorio restringido a disposición en RG N 346 personal Sección basura normal Sección Microbiologia Alimentos y Agua. Microbiología. partidos en trozos. Registro control Archivador verde Acceso Papel 5 años y esterilidad medios Registros Laboratorio restringido a disposición en de cultivo N 346 personal Sección basura normal utilizados en el Sección Microbiología Microbiología. partidos en trozos. análisis Laboratorio Alimentos y Agua. de recuentos código RG Registro análisis de Archivador azul recuento de heterótrofos, recuento de mohos y levaduras en agua de diálisis código RG Registros de Lecturas e informes de resultados Laboratorio Recuento aerobios mesófilos, S.aureus, Mohos y levaduras Sección Microbiología Alimentos Acceso restringido personal Sección Microbiología. Papel 5 años y a disposición en basura normal partidos en trozos.

12 PRT Página 12 de 15 Identificación del registro Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención disposición y Agua. y 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio 1 1 Se elimina formato página 1 por cambio en formato de documento institucional. 1 1 a 11 Se cambia el formato del encabezado de página a todo el documento. Fecha Aprobación Se corrige PRT por PRT Se deja pie de página sólo en página 1 y se actualizan los cargos. 1 2 Se actualiza edición referencia 4.1 a 21 th Ed 2005 Pág a Se eliminaron los puntos 4.2 y Se incluye el punto MATERIALES Y EQUIPOS y sus ítemes. 1 3 En el punto 6.4 es cambiado a y se le agregó a la frase: (rango 20 C a 28 C) o incubadora a 35 C ± 1 C) 1 3 En el punto 6.5 se cambió a y se corrigió ±1 C por : 47 ºC ± 2 º C. 1 3 En el punto 6.2 se enumeró los ítemes respectivos. Al segundo párrafo se le asignó el punto y se agregó:... o agua buffer fosfato,... 9 ± 0,2 ml...9 y 10 ml o en frascos con 99 ± 2 ml.

13 PRT Página 13 de 15 Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobación Al párrafo 3 se le asignó en número y se actualizó edición por: 21 th Ed En el punto se corrigió: PRT por. PRT PRT por : PRT En el punto se agregó:... diluyente o 1 ml en 99 ml de diluyente ( dil 10 ²). 1 4 En el punto se agregó:... temperatura entre el rango 20 ºC y 28 C En el punto se agregó:... de la muestra directa Se agregó punto cambiando el orden al resto de los ítemes. 1 4 El punto pasa a ser el punto y se corrigió:...48 C por: 47 ± 2 ºC. 1 4 El punto se convirtió en el punto y se agregó:... temperatura entre el rango de 20ºC a 28 C En el punto se conviertió en el punto se cambia...especificados en el punto 10.0 por : respectivos. 1 4 El punto cambió a 7. 2 y sus respectivos ítemes 1 5 El párrafo cuarto se cambió RG por : RG punto 10.0 por punto El punto 7.2 se transformó en 7.3 y se agregó: Para el recuento de heterótrofos se sugiere indicar el método usado, tiempo y temperatura de incubación y el medio de cultivo seleccionado. Para el cálculo El punto se modificó a y se agregó un subitem. 1 5 El punto a) se cambió por a1) se cambió por

14 PRT Página 14 de 15 Revisión Nº Pág. Motivo del cambio Fecha Aprobación Modificada a2) se cambió por con sus ítemes desde el al En punto a2) se agregó:... como sigue : 1 5 En la primera viñeta de la letra a2) se cambió 12 por 13 y 6 por 7. Se agregó párrafo. 1 5 En la tercera viñeta de la letra a2) se agregó:... calcule el valor estimado multiplicado por el factor de dilución respectivo y por el área correspondiente a la placa utilizada o bien calcule el valor estimado como > 100 ufc/ cm² multiplicado por el área correspondiente a la placa utilizada y divida por el volumen menor de muestra sembrada. 1 6 El punto b) cambió a y su ítem Se agregó: Cuando el número de colonias desarrollado en 2,0 ml es inferior a 30 registre el resultado observado e informe como recuento en placa estimado ( RPES) < 30 ufc/ ml. Si fuese necesario realizar el cálculo, promediar el recuento de la misma dilución de las placas en duplicado e informar como recuento en placa estimado (RPES). 1 6 El punto c) cambió a y su ítem respectivo: al cual se le agregó al final de la frase: e informar como < 1 ufc /ml. 1 6 El punto d) se cambió por por cambio de viñetas de letras por números. 1 6 El punto e) cambió a por cambio de viñetas de letras por números. 1 7 El punto 7.3 se modifica a 7.4. El punto a) cambió a El punto b) cambió a

15 PRT Página 15 de 15 Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobación 1 9 El punto c) cambió a El párrafo del punto se le asignó el número El párrafo del punto se le asignó el número El párrafo del punto se le asignó el número El punto 7.4 se modifica a El punto 7.5 se modifica a Al punto 7.6 se modifico a 7.7 y se le asignaron itemes 1 11 Se cambia el punto 8.0 RESPONSABLES por REGISTROS y se agregó nueva tabla control de Registro por cambio de formato a nivel institucional Se cambia el punto 9.0 DISTRIBUCIÓN por TABLA DE MODIFICACIONES por cambio de formato a nivel institucional 1 11 Se cambia el punto 10.0 REGISTROS por ANEXOS por cambio formato a nivel institucional. 10. ANEXOS 10.1 Anexo 1 Registro análisis de recuento de heterótrofos, recuento de mohos y levaduras en agua de diálisis código RG