PROCEDIMIENTO RECUENTO DE MICROORGANISMOS HETEROTROFOS EN PLACA. METODO STANDARD METHODS FOR EXAMINATION OF WATER AND WASTEWATER

Transcripción

1 PRT Página 1 de OBJETIVO 1.1 Conocer el número de microorganismos heterotróficos viables que contiene una muestra de agua. 1.2 Verificar la calidad bacteriológica del agua de diálisis especificada en el Decreto Supremo Nº 2357/94 del MINSAL. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a matrices aguas, incluidas las aguas de diálisis que sean recepcionadas para análisis microbiológico. 3. FUNDAMENTO El método de análisis puede ser en placa en profundidad, en superficie o por membrana filtrante. Para recuento en placa en profundidad o superficie se puede utilizar un agar de alta calidad nutritiva como el agar Plate Count o un agar de baja calidad nutritiva como el agar R 2 A que también es aplicable al método de membrana filtrante. Para membrana filtrante se recomienda el agar m-hpc. Los resultados de este análisis permiten para las aguas en general: Medir los cambios durante el tratamiento y distribución Control de piscinas En cuanto a las aguas de diálisis los resultados permiten: Verificar efectividad de los procedimientos de limpieza y desinfección. Determinar el origen de la contaminación durante el proceso de diálisis. Verificar condiciones óptimas de almacenamiento y transporte del agua utilizada para alimentar el sistema de diálisis. El Decreto Supremo Nº 2357/94 especifica que la calidad bacteriológica del agua a usar en diálisis " cada centro de diálisis debe realizar un cultivo semestral del agua teniendo como recuentos máximos aceptables 200 UFC/mL en agua tratada y 2000 UFC/mL del líquido de diálisis post dializador. 4. REFERENCIAS 4.1 Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 21th Ed 2005 pag a 9-38.

2 PRT Página 2 de TERMINOLOGÍA 5.1 Heterotroficos: Organismos que se alimentan de sustancias orgánicas. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES Y EQUIPOS Placas Petri estériles de vidrio o de plástico de mm de diámetro Tubos de 16 x 160 mm marcados en 9 y 10 ml, que contengan 9 ml de solución diluyente estéril Pipetas bacteriológicas estériles de 1 ml Incubadora regulada a 25 ± 1 C (rango 20 C a 28 C) o incubadora a 35 C ± 1 C Baño de agua termorregulado a 47 ºC ± 2 º C Agitador de tubos Contador de colonias, tipo Quebec de campo oscuro o equivalente. 6.2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS AGUA RECOMENDADA PARA USO EN MICROBIOLOGIA Para preparar medios de cultivo, reactivos y blancos de dilución sólo se debe usar agua que ha sido tratada por desionizador, para dejar libre de trazas de metales disueltos y componentes bactericidas e inhibitorios DILUYENTE: Agua peptonada estéril 0.1 %, (Straka and Stokes, 1957) ph 7± 0.1 o agua buffer fosfato, distribuida en volúmenes de 9 ± 0,2 ml en tubo tapa rosca marcado en 9 y 10 ml o en frascos con 99 ± 2 ml AGAR PARA RECUENTO EN PLACA: Es recomendable usar un agar pobre en nutrientes como el agar R 2 A ph 7.2 con el cual se obtienen recuentos mas altos que con agar Plate Count. En caso de no contar con este agar se puede usar Agar Plate Count Agar o Standard Methods Agar estéril, ph 7±0.1, distribuido en frasco Schott con 200 ml. La formulación de Merck código es idéntica a la descrita en Standard Methods for Examination of Water and Wastewater 21th Ed (Fórmula agar R 2 A: extracto de levadura 0,5 g, proteosa peptona 0,5 g, casamino ácido 0,5 g, glucosa 0,5 g, almidón soluble 0,5 g, dipotasio hidrógeno fosfato 0,3 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, piruvato de sodio 0,3 g, agar 15 g, agua 1 L ph 7.2, esterilizar a 121 ºC por 15 minutos).

3 PRT Página 3 de DESARROLLO 7.1 PROCEDIMIENTO RECUENTO EN PLACA EN PROFUNDIDAD Recibir en el Laboratorio de Recuentos, las muestras enumeradas en el Laboratorio de Recepción de Muestras de esta sección. Estas muestras son procesadas según el PRT de "Procedimiento de Recepción de las muestras" y el PRT de "Procedimiento de procesamiento de muestras de alimentos y agua" Es importante que una vez recolectada la muestra el análisis se inicie lo más pronto posible para minimizar los cambios en la población bacteriana Se recomienda que el tiempo máximo entre la recolección de muestras y el análisis no supere las 8 h (tiempo máximo de transporte 6 h y tiempo máximo para el proceso de análisis 2 h). Si no se puede analizar dentro de las 8 h mantener refrigerado a < 4ºC sin congelar. En estas condiciones el tiempo máximo entre la recolección de muestra y el análisis no debe superar las 24 h Anotar en cuaderno de inscripción el número que identifica las muestras a sembrar Verificar que el volumen de cada tubo de dilución marcado, contengan 9 ml Agitar la muestra 25 veces en arco de 30 cm por 7 segundos o en vórtex por 15 segundos Preparar diluciones decimales de 10 1, 10 ², 10 ³, etc. a partir de la muestra líquida directa 1 ml a un tubo con 9 ml de diluyente o 1 ml en 99 ml de diluyente (dil 10 ²). Agitar y proceder de igual forma para las diluciones siguientes Identificar las placas Petri con lápiz azul las que se incubarán a temperatura entre el rango 20 ºC y 28 por 5 a 7 días o a 35ºC por 48 h, dependiendo del propósito del análisis. Para el monitoreo de los cambios de la calidad del agua, los más altos recuentos serán obtenidos de incubaciones entre 5 a 7 días y entre 20 a 28 ºC. Colocar, número de la muestra y dilución a cada una de ellas Sembrar 1 ml por duplicado de la muestra directa y cada dilución en placas estériles previamente identificadas. Sembrar como mínimo dos diluciones consecutivas También se pude sembrar 1 ml en duplicado de la muestra directa y 0,1 ml en duplicado de la muestra directa. A continuación diluir 10 ² tomando 1 ml de la muestra directa en 99 ml de diluyente y sembrar de esta dilución 1 ml en duplicado y 0,1 ml en duplicado. Sembrar como mínimo 2 diluciones consecutivas.

4 PRT Página 4 de Utilizar una pipeta para cada dilución y para remover las alícuotas tanto de la muestra directa como en las diluciones no inserte la pipeta más de 2 a 3 cm debajo de la superficie Al descartar la alícuota a sembrar en la placa mantener la pipeta en un ángulo de 45º con la punta tocando el fondo de la placa o en el interior del cuello del tubo de dilución Levantar la tapa de la placa lo suficientemente alto para insertar la pipeta En una pipeta de 1mL el tiempo estimado para drenar o vaciar el contenido desde una marca a la punta es de 2 a 4 segundos Si la pipeta no es de vaciado completo, tocar una vez la punta de la pipeta en una zona seca en el fondo de la placa Petri y drenar el volumen restante En muestras turbias o aguas residuales remover volúmenes de muestra de 0,1mL o menor a partir de las diluciones. No utilice 0,1 ml de muestra directa pero prepare apropiadas diluciones. Y utilice siembra en duplicado para cada dilución Verter en cada placa Petri aproximadamente 15 ml de agar R 2 A o Plate Count. previamente fundido y mantenido en baño de agua a 47 ± 2 ºC. La elección del agar es conforme al objetivo el análisis, es decir el agar Plate Count se recomienda si el laboratorio desea hacer comparaciones del medio o continuar con datos anteriores de análisis realizados con Plate Count. El agar R 2 A se recomienda para análisis que requieren un valor más exigente en la enumeración Mezclar el inóculo con el medio fundido, inclinando y girando las placas. La forma adecuada de llevar a cabo esta operación sería la siguiente: Mover la placa con movimientos de vaivén 5 veces en una dirección, Hacerla girar 5 veces en el sentido de las agujas del reloj, Mover con movimientos de vaivén en una dirección que forme ángulo recto con la primera y Hacerla girar 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj El tiempo estimado entre el comienzo del análisis y el vertido del agar no debe sobrepasar los 20 minutos Una vez solidificado el agar, invertir las placas rápidamente para prevenir el crecimiento de colonias invasivas por acumulación de humedad. Incubar a temperatura entre el rango de 20ºC a 28 C durante 6 días ± 1 día o a 35ºC por 48 h dependiendo del propósito del análisis.

5 PRT Página 5 de Durante la incubación mantener la humedad dentro de la incubada de tal menera que las placas no pierdan más del 15% de humedad en peso. Para impedir la pérdida de humedad ubicar un recipiente con agua al fondo de la incubadora pero para evitar la oxidación de las paredes por dentro y bandejas éstas deberían ser acero inoxidable de alta calidad o de aluminio anodizado. Para incubaciones por largo período en incubadoras no humedificadas, sellar las placas en bolsas plásticas Con el fin de validar los resultados se recomienda realizar controles de ambiente, control de esterilidad del medio de cultivo y diluyente y registrar esta información en los registros respectivos. 7.2 LECTURA Luego de cumplir el período de incubación, realizar la lectura de las placas Si no es posible leerlas prontamente, guardarlas a 4ºC por no más de 24 horas, pero esto no hay que hacerlo de rutina Realizar el recuento con un contador de colonias modelo Quebec de campo oscuro u otro equivalente que de un aumento e iluminación equivalente Examinar las muestras dudosas con mayor aumento para distinguir las colonias de materias extrañas Evitar la fatiga ocular que puede causar imprecisiones Anotar la dilución usada y el número de colonias contadas en cada placa Registrar los resultados en el registro RG y los controles realizados en los registros especificados en el punto 8. de este procedimiento 7.3 RECUENTO DE COLONIAS Y REGISTRO Para el recuento de heterótrofos se sugiere indicar el método usado, tiempo y temperatura de incubación y el medio de cultivo seleccionado. Para el cálculo de recuento de colonias en placa se realiza de acuerdo al siguiente esquema: Placas normales ( colonias): Seleccionar las placas libres de crecimiento invasivo Contar todas las colonias incluyendo aquellas de tamaño muy pequeño Anotar por dilución, el número de colonias contadas en cada placa.

6 PRT Página 6 de Realizar el cálculo para recuento de microorganismos heterótrofos en placa, dividiendo el número total de colonias por placa por el volumen de muestra o calcular el promedio (duplicado de palcas de la misma dilución) multiplicado por el factor de dilución correspondiente Casos especiales Si no se tienen placas que cumplan con el requisito anterior, proceder de la siguiente manera: Placas sobrepobladas (mas de 300 colonias) : Anotar los recuentos de placas sobrepobladas como muy numerosos para contar (MNPC) cuando disponga de placas normales Si una o más placas presentan más de 300 colonias, para el cálculo utilice las placas más cercanas a 300 colonias. Ccalcular el promedio e informar como recuento estimado Si no dispone de placas normales en las diluciones sembradas y el número de colonias lejos excede 300 colonias contar las colonias en porciones de la placa si su distribución es homogénea y calcular el recuento estimado en placa (RPES) como sigue: Si hay menos de 10 colonias por cm², contar las colonias en 13 cuadrados, seleccionar 7 cuadrados consecutivos horizontales de la placa y 6 cuadrados consecutivos verticales formando ángulo recto, contar cada cuadrado sólo una vez.la suma de las colonias de los 13 cuadrados multiplicar por 5 para calcular el número de colonias por placa correspondiente a un área de 65 cm 2 o bien calcular el promedio de los 13 cuadrados y multiplicar por 65, multiplicar el valor final por el factor de dilución respectivo. Para placas de área 57 cm 2 calcular el promedio, multiplicar por 57 y por el factor de dilución respectivo Si hay más de 10 colonias por cm² contar las colonias en cuatro de tales porciones. En ambos casos, multiplicar el número promedio de las colonias contadas por cm² por el área de la placa usada para estimar el número de colonias por placa. Cada laboratorio debe determinar el área en cm² de las placas usadas Si hay mas de 100 colonias por cm², registrar como >100 ufc / cm² y calcule el valor estimado multiplicado por el factor de dilución respectivo y por el área correspondiente a la placa utilizada o bien calcule el valor estimado como > 100 ufc/ cm² multiplicado por el área correspondiente a la placa utilizada y divida por el volumen menor de muestra sembrada.

7 PRT Página 7 de Placas con menos de 30 colonias (< 30 colonias) Comúnmente no se siembra más de 2,0 ml de muestra, sin embargo cuando el número de colonias desarrollado en 2,0 ml es inferior a 30 registre el resultado observado e informe como recuento en placa estimado (RPES) < 30 ufc/ ml. Si fuese necesario realizar el cálculo, promediar el recuento de la misma dilución de las placas en duplicado e informar como recuento en placa estimado (RPES) Placas sin desarrollo de colonias Cuando ninguna de las placas presente desarrollo de colonias, registrar como sin desarrollo en la dilución correspondiente (SD) e informar como < 1 ufc /ml Crecimiento invasivo Las colonias invasivas son generalmente de tres tipos: El primer tipo son las colonias en cadenas, que al parecer son causadas por desintegración de un grupo de bacterias cuando la placa Petri es rotada para mezclar el agar con la alícuota analizada. Si solamente existe una de tales cadenas contar como una colonia. Si una o mas cadenas parecieran originarse de fuentes distintas, contar cada fuente como una colonia. No contar cada crecimiento individual de tal cadena como una colonia El segundo tipo de colonia invasora es la que se desarrolla en una película de agua entre el agar y el fondo de la placa Petri El tercer tipo es la que se forma en una película de agua en el costado o en la superficie del agar Estos dos últimos tipos revelan una acumulación de humedad en el punto en el cual se origina el crecimiento invasivo. Cuando la alícuota de siembra es uniformemente distribuída en el medio, las bacterias raramente desarrollan colonias invasivas Si en las placas seleccionadas se presenta invasión, realizar recuento de colonias solamente: Si el área invadida no excede la mitad de la placa Si las colonias están bien distribuidas fuera del área invadida, donde las colonias individuales aparecen próximas pero no se tocan a una distancia al menos igual al diámetro de la colonia más pequeña Contar las colonias que difieren en apariencia como morfología y color como colonias individuales.

8 PRT Página 8 de Si no se cumple lo anterior, registrar como crecimiento invasivo o accidente de laboratorio Los laboratorios con un 5 % de placas cubiertas con más de 1/4 de las placas con crecimiento invasivo, deberían tomar medidas inmediatas, para eliminar este problema (reducir la humedad ambiente en la cámara o estufa de incubación y mezclar cuidadosamente el agar con la siembra) Accidente de laboratorio o inhibidores de crecimiento bacteriano: Cuando una placa presenta contaminación u otra condición insatisfactoria registrar como "Accidente de Laboratorio". Especificar El analista puede sospechar la presencia de sustancias inhibidoras en las muestras que están siendo analizadas, cuando las placas no tienen crecimiento o tienen proporcionalmente menos crecimiento en las diluciones mas bajas. Tal resultado no debería ser interpretado como evidencia de inhibidores hasta confirmar la presencia de ellos en el producto. 7.4 EXPRESION DE RESULTADOS Cálculo y registro de resultados Para los cálculos del Recuento Standard en placa considerar sólo los dos primeros dígitos Si el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9 adicionar una unidad al segundo dígito. Si el tercer dígito es 1, 2, 3 o 4 considerar solamente los dos primeros dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una unidad al segundo dígito si este es impar y mantener el segundo dígito si este es par Usar ceros para los demás dígitos hacia la derecha. Ejemplo: Lectura calculada Rto Heterotroficos

9 PRT Página 9 de Placas normales Cuando los recuentos de los duplicados de placas de sólo una de las diluciones caen dentro del rango 30 a 300 colonias : Utilizar para el cálculo los recuentos obtenidos en placas normales Sacar promedio y multiplicar por el factor de dilución Si los recuentos de las placas de dos diluciones consecutivas caen dentro del rango colonias calcular el RAM según la siguiente fórmula: N = Σ C [ ( 1 x n1 ) + ( 0.1 x n2 ) ] x d donde : N = número de colonias por ml o g de producto Σ C = suma de todas las colonias contadas en todas las placas n1 = número de placas contadas de la menor dilución. n2 = número de placas contadas de la dilución consecutiva. d = dilución de la cuál fue obtenido el primer recuento Ejemplo 1 : : y y 28 N = [( 1 x 2 )+( 0.1 x 2 )] x 0,01 = = = 24000

10 PRT Página 10 de Cuando los recuentos de las placas en duplicado caen tanto dentro como fuera del rango colonias, usar sólo aquellos recuentos que estén dentro de este rango Todas las placas con menos de 30 colonias Cuando las placas de ambas diluciones tienen menos de 30 colonias cada una, informar el recuento como menor de 30 por el recíproco del factor de dilución menor. Ejemplo 1 : : Rto ( ml o g ) 18 2 < < Todas las placas con mas de 300 colonias Cuando las placas de ambas diluciones tienen más de 300 colonias cada una (pero menos de 100 por cm²) contar las placas más cercanas a 300, sacar promedio y multiplicar por el recíproco de la dilución. Ejemplo 1 :100 1 : Rto ( ml o g ) MNPC estimado ( RPES ) ( MNPC = Muy numeroso para contar ) Todas las placas con mas de 100 colonias promedio por cm² Estimar que el Rto es mayor de 100 veces la mayor dilución sembrada, por el área de placa utilizada y por el recíproco de la dilución. Ejemplo 1 : : R A M ( ml o g ) TNPC 7.150* > * ( RPES ) TNPC 6.490** > **( RPES ) * basado en un área de placa de 65 cm² ( 9 cm Ø ) ** basado en un área de placa de 57 cm² ( 8,5 cm Ø )

11 PRT Página 11 de Todas las placas con crecimiento invasivo, presencia de inhibidores o accidente de laboratorio Informar según corresponda. 7.5 INFORME DE RESULTADOS Informar el recuento de heterotróficos en unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro (UFC/mL) Expresar el Resultado con sólo un número entero y un decimal multiplicado por 10 elevado a la potencia correspondiente. Ej ,4 x 103 UFC/mL. 7.6 REPRODUCIBILIDAD Y ERROR PERSONAL El resultado obtenido al contar por segunda vez las colonias de una placa determinada debe presentar: Una diferencia máxima del 5% en el caso de que este recuento lo realice la misma persona Una diferencia máxima del 10% en el caso de que este recuento lo haya realizado otra u otras personas Cuando la diferencia entre ambos es superior a estos límites, puede deberse a defectos visuales, a la dificultad de reconocer las colonias muy pequeñas o lo que es mas frecuente, a la incapacidad para diferenciar las colonias de las partículas más pequeñas. 7.7 CONTROLES Chequear esterilidad de: Agua de dilución Agar para recuento en placa ( Plate Count o agar Standard Methods) Pipetas Placas Petri

12 PRT Página 12 de Control de ambiente por método de sedimentación en placa: Mesón de siembra Flujo laminar Control de temperatura Control de temperatura de incubadora diariamente a 1ª hora de la mañana y a última hora en la tarde Control de temperatura del baño termorregulado para mantener agar cada día que se siembren muestras. 8. REGISTROS 8.1 Registro análisis de recuento de heterótrofos 9. ANEXOS No Aplica