PROCEDIMIENTO NMP PARA LA DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES EN AGUAS POR METODO A-1 PRT

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1 Página 1 de 6 1. OBJETIVO Este análisis se realiza para estimar la densidad de coliformes fecales en agua, con una incubación de 24 hrs. por lo cual se obtienen resultados en menor tiempo que el método tradicional. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Este procedimiento se aplica a muestras de aguas crudas y agua de mar. 3. FUNDAMENTO El caldo A-1 puede ser usado para aislamiento directo de coliformes fecales desde agua, no requiere una etapa de preenriquecimiento. 4. REFERENCIAS 4.1 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 ª Ed Capítulo E.2 pag TERMINOLOGÍA 5.1 Grupo coliformes fecales: Coliformes fecales se definen como bacilos Gram negativos aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando ácido y gas dentro de 24 hrs. a 44,5 ± 0,2ºC. En la actualidad se utiliza el grupo coliformes fecales, especialmente para calificar sanitariamente la calidad del agua. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 EQUIPOS Incubadora a 35º ± 0,5ºC Baño de agua termorregulado a 44,5º ± 0,2º C Termómetros calibrados con graduaciones de 0,1ºC 6.2 MATERIALES Pipetas graduadas de 1, 5 y 10 ml Placas Petri de 100 mm de diâmetro

2 Página 2 de Tubos o botellas de dilución, de vidrio borosilicato con tapas herméticas Tubos de fermentación de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm Asa de 3 mm de diámetro Propipeta 6.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Medio A1 doble concentración Medio A1 concentración simple Agua de dilución buffer fosfato estéril o agua peptonada estéril 0.5% 6.4 CEPAS CONTROL Cepa control positivo: Escherichia coli Cepa control negativo: Enterobacter aerogenes 7. DESARROLLO 7.1 SIEMBRA Se utiliza caldo A-1 en tubos de fermentación y como diluyente, agua de dilución buffer fosfato estéril o agua peptonada estéril 0.5% Agitar la muestra y diluciones, vigorosamente 25 veces en 7 segundos en un arco de 45º con movimientos de arriba a abajo, para asegurar la homogeneidad de la muestra; este procedimiento debe repetirse antes de inocular cada serie de diluciones Inocular 5 tubos de caldo A-1 doble concentración con 10 ml de muestra cada tubo Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentración simple con 1 ml de muestra cada tubo Transferir 1 ml de muestra a un tubo que contenga 9 ml de agua de dilución buffer fosfato o agua peptonada 0.5 % para obtener la dilución 1: Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentración simple con 1 ml de la dilución 1:10 cada tubo Transferir 1 ml de muestra a un tubo que contenga 9 ml de agua de dilución buffer fosfato o agua peptonada 0.5 % para obtener la dilución 1: Inocular 5 tubos de caldo A-1 concentración simple con 1 ml de la dilución 1:100 cada tubo.

3 Página 3 de Inocular un tubo de medio con A-1 con control positivo utilizando una cepa de Escherichia coli y otro con el control negativo utilizando una cepa de Enterobacter aerogenes. Incluir tubos de medios de cultivo sin inocular para controlar la esterilidad de los medios de cultivo y placas Petri abiertas y cerradas para control de ambiente Agitar la gradilla suavemente para mezclar la muestra y el medio de cultivo e incubar los tubos inoculados en incubadora a 35º ± 0,5º C por 3 hrs para resucitación Luego transferir la gradilla a un baño de agua a 44,5º ± 0,2ºC durante 21 horas ± 2 horas Al término del período de incubación se observa la formación de gas en los tubos de fermentación. Se considera un test positivo para coliformes fecales la presencia de gas, cualquiera sea la cantidad producida o la efervescencia que se produce al agitar suavemente el tubo. Ausencia de gas o ausencia de efervescencia se considera un test negativo para coliformes fecales Anotar los resultados de las muestras en el registro RG y de las cepas control en el registro RG , de la esterilidad de los medios en el registro RG y los controles ambiente en el registro RG CALCULO La combinación de tubos positivos obtenidos se refiere a la Tabla NMP (Tabla 9221: IV St. Mt Pag. 9-54), y los resultados se expresan como NMP por 100 ml. de muestra Si en lugar de las porciones de muestra de ,1 ml, se utiliza 1-0,1-0,01, se lee el resultado en la Tabla NMP y se multiplica por 10, y si las porciones de muestra son 0,1-0,01-0,001, el resultado de la Tabla NMP se multiplica por Cuando se utilizan más de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3 series, eligiendo la dilución más alta que da resultados positivos en los 5 tubos ensayados y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer en la Tabla de NMP (Ver Ejemplos).

4 Página 4 de 6 Ejemplos de determinación de NMP en series de 5 tubos Ejemplo Volumen de muestra (ml) Lectura NMP ,1 0,01 0,001 a b c ,8 d e f EXPRESION DE RESULTADOS Los resultados se expresan como NMP Coliformes fecales/100 ml de muestra. 8. REGISTROS 8.1 RG Registro cepas control baños de agua para análisis de Coliformes fecales. 8.2 RG Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de Coliformes, Coliformes fecales y Escherichia coli. 8.3 RG Registro de resultados análisis de coliformes, coliformes fecales y E. coli en muestras de agua. 8.4 RG Registro control de ambiente. 9. ANEXOS Anexo Nº 1 Anexo Nº 2 Anexo Nº 3 Anexo Nº 4 Registro cepas control de baños de agua para análisis de coliformes fecales, RG Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de coliformes, RG Registro de resultados análisis de coliformes y coliformes fecales en muestras de agua coliformes fecales y Escherichia coli, RG Registro control de ambiente laboratorio, RG

5 Página 5 de 6 Anexo Nº 1 Registro cepas control de baños de agua para análisis de coliformes fecales, RG FECHA CONTROLES CONTROLES CONTROLES CONTROLES INIC: ( + ) ( - ) ( + ) ( - ) ( + ) ( - ) ( + ) ( - ) Anexo Nº 2 Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis de coliformes, RG FECH A Lauril Sulfato Triptosa concentra d Lauril Sulfato Triptosa simple Agar Rojo Neutro Cristal Violeta (VRB) Bilis Verde Brillant e Cald o EC Cald o A-1 Agar Rojo Neutro Cristal Violeta - Glucosa (VRBG) Agar MacConke y Sorbitol Agar glucosa (enterobacteria) INIC

6 Página 6 de 6 Anexo Nº 3 Registro de resultados análisis de coliformes y coliformes fecales en muestras de agua coliformes fecales y Escherichia coli, RG Nº:...Tipo de muestra:... Analista... Fecha /hora recolección...fecha/hora análisis:...tº Ambiental. Medios Incubadora/ Baño term. CLST (C) CLST (S) Endoles Diluyente CBCB EC MUG EC- Pipeta 1mL / 5 ml PORCION DE MUESTRA (ml) PRESUNTIVO CLST hrs 35ºC Endo Les 24 hrs. COLIFORMES CONFIRMATIVO CBVB 48 hrs. a 35 ºC E.C./E.C.-MUG 24 h/44,5+/- 0,2ºC N.M.P. Coliformes /100 ml :...germ / 100 ml N.M.P. Coliformes Fecales :...germ /100 ml Rcto Coliformes:... P/A E.coli:... Anexo Nº 4 Registro control de ambiente laboratorio, RG LABORATORIO:...MES :...AÑO :... FECHA/ LOTE CONTROL AMBIENTE MESON DE TRABAJO Lado izquierdo Lado derecho Placa abierta Placa cerrada Placa abierta Placa cerrada

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