PROCEDIMIENTO EVALUACION DE MEDIOS DE CULTIVO PRT

Transcripción

1 PRT Página 1 de OBJETIVO Asegurar la calidad de los medios de cultivos preparados en la Sección Microbiología de utilizados en los análisis microbiológicos de alimentos y agua. 2. CAMPO DE APLICACION Y ALCANCE Aplicable a medios preparados en el laboratorio y a medios comerciales listos para su uso. 3. FUNDAMENTO Para realizar análisis microbiológicos de alimentos de manera confiable, es imprescindible utilizar medios de cultivo de calidad probada. Los criterios de rendimiento mínimos de aceptación evaluados mediante los métodos definidos y que además se puede aplicar por todos los laboratorios de microbiología para evaluar las propiedades productivas, selectivas y/ o específicas de un medio de cultivo. 4. REFERENCIAS 4.1 ISO / 2002: Practical guidelines on performance testing of culture media. 5. TERMINOLOGIA 5.1 Cultivo: Formulación de sustancias, en forma líquida, semisólida o sólida, las cuales contienen constituyentes naturales y/o sintéticos que tiene como propósito permitir la multiplicación, o preservar la viabilidad de microorganismos. 5.2 Lote de cultivo: Unidad completamente trazable de un medio, referido a una cantidad de granel, producto semiterminado o producto final, el cual es consistente en tipo y calidad, y el cual ha pasado los requerimientos de producción (es en proceso) y test que aseguren la calidad, y los cuales han sido producidos en un periodo de producción definido y se les ha asignado el mismo lote de producción. 5.3 Productividad: Evaluación de la capacidad de un medio de cultivo de favorecer o permitir el desarrollo de un microorganismo que tenga una reacción positiva en dicho medio. 5.4 Selectividad: Evaluación de la capacidad de un medio de cultivo de inhibir el crecimiento o desarrollo de un microorganismo que NO tenga una reacción positiva en dicho medio.

2 PRT Página 2 de Microorganismo objetivo: Corresponde a un microorganismo conocido al nivel de género y especie, catalogado y descrito acorde a sus. Es aquel microorganismo que se desarrolla o debería desarrollar en el medio de cultivo analizado. 5.6 Microorganismo no objetivo: Corresponde a un microorganismo conocido al nivel de género y especie, catalogado y descrito acorde a sus. Es aquel microorganismo que no se desarrolla o no debería desarrollar en el medio de cultivo analizado. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1. Materiales Placas estériles de Petri Tubos 16 x 160 mm Asas calibradas 1µL Asas calibradas de 10µL Pipetas estériles1 ml y de 5 ml Cepas ATCC 6.2 s de Cultivo y Reactivos Agar no selectivo: Plate Count o Soya tripticase Caldo de cultivo no selectivo: caldo soya tripticase o caldo cerebro corazón Agares selectivos a ar Caldos selectivos a ar 6.3 Equipos Baño de agua 47 ± 2 C Incubadora regulada a 35 C ± 1 C Incubadora regulada a 30 C± 1 C 7 DESARROLLO DEL PROCESO 7.1 Preparación del cultivo de trabajo: Fase estacionaria Utilizar un caldo no selectivo como: caldo soya tripticase o caldo cerebro corazón.

3 PRT Página 3 de Dispensar en tubos una cantidad aproximada de 5 a 10 ml de caldo Inocular el caldo con la cepa objetivo de (cepa deseada) para estudio de productividad y cepa no objetivo de (no deseadas) para estudio de selectividad del medio a evaluar Incubar a 35 C por 24 horas Estimar la fase estacionaria para cada microorganismo de a utilizar, realizando diluciones seriadas y consectivas suficientes ( Ejemplo: 10 9, 10 10, ) Sembrar 1 ml u otra alícuota adecuada en duplicado de las diluciones elegidas e incubar horas a 35 C Efectuar recuento eligiendo las placas más cercanas a 250 ufc las que son equivalentes a la dilución 10 0 correspondiente a la fase estacionaria Estimar los valores de recuentos en forma descendente para las diluciones siguientes hasta llegar al valor 10 0 (Ejemplo: Fase estacionaria correspondiente a 10 0 = 8,6 x 10 9 ; 10 1 = 8,6 x 10 8 etc) Esta fase estacionaria es útil para de medios de cultivo para métodos cualitativos, cuantitativos y semicuantitativos de productividad y selectividad Estandarizar para comparar Registrar los valores en hoja de registro RG Concentraciones o densidad microbiana de trabajo del Microorganismo Objetivo (Deseado): Para ensayos cuantitativos de productividad se requiere de una concentración de 10 2 ufc por placa que es estimada conforme al valor de la fase estacionaria de la cepa objetivo Para ensayos semicuantitativos y cualitativos de productividad, se requiere de una concentración entre 10 3 a 10 4 ufc por placa que es estimada conforme al valor de la fase estacionaria de la cepa objetivo Para ensayos de productividad en medios líquidos se requiere una concentración de 10 a 10 2 ufc que es estimada conforme al valor de la fase estacionaria de la cepa objetivo Registrar los valores en hoja de registro RG

4 PRT Página 4 de Concentraciones o densidad microbiana de trabajo del Microorganismo No Objetivo ( No Deseado): Para ensayos de selectividad en placa o tubos se requiere de una concentración de cepa no objetivo entre 10 4 a 10 6 ufc por placa o tubo que es estimada conforme al valor de la fase estacionaria de la cepa No objetivo. 7.4 Productividad y Selectividad para medios de cultivo Sólidos Método en placa: Cuantitativo: Preparar tubo de caldo no selectivo (caldo soya tripticase o caldo cerebro corazón) con cepa objetivo para el cálculo de Productividad y un tubo con caldo no selectivo con cepa no objetivo para cálculo de Selectividad respectivamente Estos cultivos corresponden a la fase estacionaria Realizar diluciones seriadas y consecutivas necesarias para obtener la alícuota con la concentración requerida, 10 2 ufc para la cepa objetivo y realizar diluciones necesarias para obtener la alícuota con la concentración requerida, 10 4 a 10 6 ufc para la cepa no objetivo Sembrar en duplicado en superficie o profundidad en el medio de cultivo a evaluar y en el medio de cultivo de (Agar soya tripticase), una alícuota de 1mL; 0,1 ml u otro volumen que contenga la concentración requerida para la cepa objetivo (10 2 ufc) y para la cepa no objetivo (10 4 a 10 6 ufc) Asegurarse que las superficies de las placas estén bien secas Incubar adecuadamente por 24 a 48 h a 35 C o según las condiciones establecidas en los métodos normalizados Contar las colonias Calcular la Productividad (P R ) según fórmula: P R = N s / N 0. Donde, N s es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo sometido al ensayo (obtenido de una o más placas). N 0 es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo de definido, obtenido de una o más placas y, debe ser 100 ufc Calcular la Selectividad (S F ) según fórmula: S F = D 0 D S. Donde D 0 es la dilución más alta que muestra un crecimiento de al menos 10 colonias en el medio de. D S es la dilución más alta que muestra un crecimiento comparable en el medio que está evaluando. Tanto S F, D 0 y D S se expresan en logaritmos decimales Las de especificidad están definidas en el Anexo N 1.

5 PRT Página 5 de Interpretación: La relación de productividad de un medio no selectivo es al menos 0,7 para los microorganismos que puedan crecer fácilmente en el medio. El P R del microorganismo objetivo en un medio selectivo debería ser al menos 0,1. Estos valores son generalmente alcanzables, sin embargo se pueden aceptar criterios menos rigurosos El S F de los microorganismos no objetivos en un medio selectivo debería ser al menos Registrar los valores en hoja de registro RG Método en placa: Semicuantitativo basado en ecométrico para medios de cultivo Sólidos: Se requieren placas con 15 ml agar Soya Tripticase o Plate Count y placas con agar selectivo a evaluar s que se utilizan habitualmente para recuentos en profundidad, se pueden evaluar en superficie Preparar diluciones respectivas hasta obtener las concentraciones de trabajo a partir de la fase estacionaria de cepa objetivo cuya concentración requerida es de 10 3 a 10 4 ufc y de la cepa no objetivo cuya concentración requerida es de 10 4 a 10 6 ufc Sembrar en estría con asa de 1µL, realizando cuatro líneas paralelas a intervalos de aproximadamente 0,5 cm en el sector A. La siembra en estría se repite en los sectores B y C y se acaba en el sector D con una sola línea. Se puede utilizar una plantilla bajo la placa para facilitar la siembra en estría. Ver figura N Se emplea la misma asa para sembrar en estría todos los sectores y sin flamear entre las estrías Incubar por 24 a 48 h a 35 C o según las condiciones establecidas en los métodos normalizados Interpretación de las líneas de crecimiento y cálculo índice de crecimiento G I obtenido por una cepa objetivo en donde cada línea tiene un valor = 1 con un mínimo de 6 para que se pueda concluir que el medio es aceptable. Para medios no selectivos el G I es generalmente más elevado Estrías sin crecimiento o desarrollo escaso se marca como El crecimiento de cepas objetivo debe ser típico y el crecimiento de las cepas no objetivo debe ser parcial o completamente inhibido.

6 PRT Página 6 de Registrar los valores en hoja de registro RG Método en placa: cualitativo de siembra en estría (Para medios sólidos) Preparar placas con 15 ml de Agar Plate Count o agar Soya tripticasa (TSA) y placas con agar selectivo a evaluar Los medios que habitualmente se siembran en profundidad se pueden ensayar en superficie Caldo de cultivo no selectivo con cepa objetivo y caldo de cultivo con cepa no objetivo respectivamente y provenientes de fase estacionaria Realizar diluciones correspondientes para obtener las concentraciones adecuadas y estimar que en 1µL se obtendrá 10 2 ufc para cepa objetivo y 10 4 a 10 6 ufc para cepa no objetivo.

7 PRT Página 7 de Con asa de 1 µl sembrar una línea recta en superficie Incubar por tiempo y temperatura de incubación establecidos en los métodos normalizados Interpretación resultados: rangos: (sin desarrollo lento o escaso buen desarrollo) Registrar los valores en hoja de registro RG Método para medios de cultivo líquidos: Siembra en placa: Método cuantitativo de dilución para cepa objetivo y no objetivo Aplicable a medios de cultivo nuevos o soluciones de dilución Preparar tubos con 10 ml de caldo seleccionado para evaluar (seleccionar un apropiado N de tubos) Preparar tubos con 10 ml del caldo de (caldo soya tripticase) Inocular con la cepa objetivo ambos caldos por separado con una concentración del microorganismo de 10 a 100 ufc / tubo. Mezclar Inocular con microorganismo no objetivo ambos caldos por separado con Concentración > ufc/tubo. Mezclar Inocular con cepa objetivo y con cepa no objetivo, cultivo mixto, ambos caldos por separado con una concentración del microorganismo objetivo de 10 a 100 ufc/tubo + una concentración del microorganismo no objetivo de >1.000 ufc/tubo. Mezclar Incubar a temperatura y tiempo establecidos en los métodos normalizados Sembrar un volumen apropiado en superficie en placas agar no selectivo Después de la incubación contar colonias de cada medio y provenientes de cada tubo respectivo En el caso de los tubos con el pool de microorganismos contar diferenciadas Lectura, cálculo de P R y S F según el procedimiento descrito en el numeral y Interpretación: Productividad satisfactoria o aceptable: Microorganismo objetivo P R 0,1 o recuentos entre 10 6 a 10 8 ufc/ml.

8 PRT Página 8 de Selectividad satisfactoria o aceptable: Microorganismo no deseado S F. 2 o recuentos 10 4 ufc/ ml En los cultivos mixtos o pool el crecimiento de los microorganismos objetivo no debe ser inhibido por los microorganismos no objetivo, es decir los microorganismos objetivos debe ser siempre la población dominante Registrar los valores en hoja de registro RG Control a los diluyentes: Se inoculan los líquidos de dilución con los microorganismos de (por ejemplo, de 100 ufc a ufc por cada tubo). Mezclar Líquido de dilución incubar 45 minutos a temperatura ambiente y después sembrar en placa Para los medios de transporte incubar a tiempo y temperatura apropiados a su uso habitual Sembrar una alícuota o si es necesario una dilución después de la etapa de incubación y se vuelve a aislar sobre superficie en placas agar no selectivo para obtener recuentos dentro de los límites establecidos Después de la incubación el N de microorganismos debe estar entre ± 50 % del recuento inicial. No se requieren ni un número reducido ni superior de organismos objetivo y/ o no objetivo Realizar el de esterilidad agregando un volumen no menor a 10 ml del diluyente, por cada lote de producción, a un volumen de caldo soya tripticasa, manteniendo una relación de volumen de 1/ Incubar la mezcla por 24 horas a 35 ºC y verificar el desarrollo de microorganismos Registrar los valores en hoja de registro RG Método Semicuantitativo del tubo único para microorganismos objetivo, no objetivo y mixtos Seleccionar el caldo dispensado en 10 ml para evaluar Inocular con microorganismo objetivo y no objetivo, haciendo pool: inocular 1 tubo del caldo a evaluar con 10 a 100 ufc del microorganismo objetivo y en el mismo tubo inocular con microorganismo no objetivo una concentración >1.000 ufc /tubo. Mezclar.

9 PRT Página 9 de Inocular con microorganismo no deseado una concentración >1.000 ufc a un tubo de medio a prueba Incubar a tiempo y temperatura establecidos en los métodos normalizados Remover con asa 10 µl (3mm) desde el tubo con cultivo mixto y sembrar en estría para aislar sobre placa de agar selectivo específico para microorganismo objetivo Remover con asa 10 µl desde cultivo con microorganismo no objetivo y sembrar por estría de aislamiento en medio no selectivo (TSA) Incubar ambas placas en condiciones apropiadas durante un tiempo adecuado, como se indica en las normas individuales Interpretación resultados: Productividad aceptable en medio cultivo líquido a evaluar es al menos con 10 colonias de microorganismo objetivo en agar selectivo Selectividad aceptable en medio de cultivo líquido a evaluar es si no hay desarrollo o el crecimiento es < 10 col del microorganismo no objetivo en agar no selectivo Registrar los valores en hoja de registro RG Método Cualitativo para tubo único Apropiado para ensayos de rendimiento de medios de cultivo líquidos y las puntuaciones son sólo indicativas Los medios que por naturaleza son turbios, como el caldo tetrationato, no se pueden evaluar por este método Para probar el rendimiento de los medios de cultivo líquidos se siembran directamente empleando un asa de 1µL los cultivos de trabajo en el medio que se está probando Se utilizan los tiempos y temperaturas de incubación establecidos en los métodos normalizados individuales No hay siembra en agar Interpretación resultados: rango para turbiedad (turbidez nula, turbidez ligera, turbidez elevada) Registrar los valores en hoja de registro RG

10 PRT Página 10 de 25 8 REGISTROS 8.1 Registro de preparación y evaluación de medios de cultivo y reactivos 9 ANEXOS Anexo N 1: Tabla microorganismos recomendados para.

11 PRT Página 11 de 25 ANEXO N 1 MICROORGANISMOS RECOMENDADOS PARA CONTRO L Tabla 1 s selectivos para recuento de microorganismos Norma Función Incubación Cepas Baird Parker S a) Estafilococos coagulasa positivos EN ISO Productividad 24 h 48 h/ 37ºC S. aureus ATCC 6538 TSA Cuantitativo PR 0,5 Colonias negro/gris con S. aureus ATCC b) halo claro (reacción de aclaramiento de la yema de huevo) Selectividad 48 h/ 37ºC E. coli ATCC ó 8739 b) Cualitativo Inhibición total Especificidad 24 h 48 h/ 37ºC S. epidermidis ATCC b) Cualitativo Colonias negro/gris sin reacción de aclaramiento de la yema de huevo RPFA S Estafilococos coagulasa positivos EN ISO Productividad 24 h 48 h/ 37ºC S.aureus ATCC 6538 ó 6538 P S. aureus ATCC 25923b) TSA Cuantitativo PR 0,5 Colonias negro/gris con halo de opacidad RPFA Estafilococos coagulasa EN ISO Selectividad 48 h/ 37ºC E. coli ATCC ó 8739b) Cualitativo Inhibición total

12 PRT Página 12 de 25 Norma Función Incubación Cepas S positivos Especificidad 24 h 48 h/ 37ºC S.epidermidis ATCC 12228b) Cualitativo Colonias negro/gris sin halo de opacidad Tabla 1 s selectivos para recuento de microorganismos (continuación) Microorganismo s Norma Función Incubación Cepas Cloranfenicol u OGA (OGY) S Levaduras/ Mohos MRS S Bacterias ácido láctica ISO 7954 Productividad 35 días/ 25ºC Selectividad 35 días/ 25ºC C. albicans ATCC A. niger ATCC b) P. cyclopium ATCC S. cerevisiae ATCC 9763 b) E. coli ATCC ó 8739 b) B. subtilis ATCC 6633 ISO Productividad 72 h/ 30ºC L. sake ATCC b) Ped. damnosus ATCC Lc. lactis ATCC b) Lote de medio SDA (Sabouraud Dextrosa Agar) u OGA o Agar cloranfenicol Cuantitativo PR 0,5 Colonias según cada especie Cualitativo Inhibición total Lote de medio MRS ya validado Cuantitativo PR 0,5 Colonias según cada especie

13 PRT Página 13 de 25 Microorganismo s Norma Función Incubación Cepas MYP S Bacillus cereus Oxford S Listeria monocytogenes EN ISO 7932 (NCh3116) EN ISO (NCh2657/2) Selectividad 72 h/ 30ºC E.coli ATCC u 8739 b) Productividad 24 h 48 h/ 30ºC B. cereus ATCC Cualitativo Inhibición total B. cereus ATCC b) TSA Cuantitativo PR 0,7 Colonias rosa con halo de precipitación Selectividad 48 h/ 37ºC E. coli ATCC u 8739 b) Cualitativo Inhibición total Especificidad 48 h/ 37ºC B. subtilis ATCC 6633 b) Colonias amarillas sin halo de precipitación Productividad 48 h/ 37ºC L. monocyt. 1/2a ATCC TSA Cuantitativo PR 0,5 Colonias de gris a L. monocyt. 4b ATCC b) negro con halo negro Selectividad 48 h/ 37ºC E. coli ATCC u 8739 b) E. faecalis ATCC u C. albicans ATCC Cualitativo Inhibición total

14 PRT Página 14 de 25 Tabla 1 s selectivos para recuento de microorganismos (continuación) Norma Función Incubación Cepas PALCAM S Listeria monocytogenes TS(C) S Clostridium perfringens VRBG S Enterobacterias EN ISO (NCh2657/2) EN ISO 7937 (NCh3061) ISO 7402 ISO 8523 Productividad 48 h/ 37ºC L. monocyt. 1/2a ATCC TSA Cuantitativo PR 0,5 Colonias grisverdosas a negro L. monocyt. 4b ATCC b) con halo negro Selectividad 72 h/ 30ºC E. coli ATCC u 8739 b) Productividad 20 h/ 37ºC atmósfera anaerobia Selectividad TSC 20 h/ 37ºC atmósfera anaerobia E. faecalis ATCC ó Cl. perfringens ATCC Cl. perfringens ATCC Cualitativo Inhibición total Lote de medio TS(C) ya validado Cuantitativo PR 0,7 Colonias negras E. coli ATCC u 8739 Cualitativo Inhibición total Especificidad TS Cualitativo Colonias blancas Productividad 24 h/ 37ºC E. coli ATCC u 8739 b) S. typhimurium ATCC TSA Cuantitativo PR 0,5 Colonias de rosado a rojo con o sin halo de precipitación Selectividad 24 h/ 37ºC E.faecalis ATCC ó b) Cualitativo Inhibición total VRBL S Coliformes ISO 4832 Productividad 24 h/ 30ºC E. coli ATCC u 8739 b) TSA Cuantitativo PR 0,5 Colonias púrpura con o sin halo de precipitación Selectividad 24 h/ 30ºC E. faecalis ATCC ó b) Cualitativo Inhibición total

15 PRT Página 15 de 25 Norma Función Incubación Cepas Especificidad 24 h/ 30ºC Ps. aeruginosa ATCC Cualitativo Colonias de incoloras a beige CTSMAC S Escherichia coli O157 ISO Productividad 24 h/ 37ºC E. coli O 157:H7 ATCC ó b) (no tóxicas) TSA Cuantitativo PR 0,5 Colonias transparentes con un aspecto amarillento pálido marrón y un diámetro de aproximadamente 1 mm Selectividad 24 h/ 37ºC S.aureus ATCC 6538 ó b) Cualitativo Inhibición total Especificidad 24 h/ 37ºC E. coli ATCC ó b) Cualitativo Colonias rosadas Tabla 1 s selectivos para recuento de microorganismos (conclusión) Norma Función Incubación Cepas BGBLB L c) Coliformes ISO 4831 Productividad 24 h 48 h/ 30ºC Selectividad 24 h 48 h/ 30ºC E. coli ATCC u 8739 b) C. freundii ATCC Semicuantitativo Turbidez 2+ Gas en 1/3 de la campana Durham E. faecalis ATCC ó Cualitativo Ausencia de b) crecimiento Producción de gas y turbidez

16 PRT Página 16 de 25 Norma Función Incubación Cepas LST L Coliformes ISO 4831 Productividad 24 h 48 h/ 30ºC EC L Escherichia coli E. coli ATCC u 8739 b) C. freundii ATCC Semicuantitativo Turbidez 2+ Gas en 1/3 de la campana Durham Selectividad E. faecalis ATCC ó Cualitativo Ausencia de b) crecimiento ISO 7251 Productividad 24 h 48 h/ 44ºC Selectividad 24 h 48 h/ 44ºC E. coli ATCC u 8739 b) Semicuantitativo Turbidez 2+ Gas en 1/3 de la campana Durham Ps. aeruginosa ATCC b) Cualitativo Ausencia de crecimiento Producción de gas y turbidez Producción de gas y turbidez a) S = medio sólido. b) Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mínimo). c) L = medio líquido. NOTA Para los medios de cultivo sólidos es posible también utilizar un método en placa semicuantitativo.

17 PRT Página 17 de 25 Tabla 2 s no selectivos para recuento de microorganismos Norma Función Incubación Cepas PCA S a) Flora total ISO 4833 Productividad 72 h/ 30ºC E. coli ATCC ó 8739 b) S. aureus ATCC 6538 ó 6538P B. subtilis ATCC 6633 b) TSA Cuantitativo PR 0,7 a) S = medio sólido. b) Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mínimo). Tabla 3 s de enriquecimiento selectivos Ver Anexo E Norma Función Incubación Cepas EE L a) Enterobacterias ISO 7402 ISO 8523 Productividad 24 h/ 37ºC E. coli ATCC u 8739 b) o S. typhimurium ATCC Semicuantitativo >10 col. en VRBG Colonias de rosado a rojo con o sin halo de precipitación Selectividad 24 h/ 37ºC + E. faecalis ATCC ó b) Semicuantitativo Inhibición total

18 PRT Página 18 de 25 Ver Anexo E Norma Función Incubación Cepas Half Fraser L Listeria monocytogenes EN ISO Productividad 24 h/ 30ºC L. monocyt. 1/2a ATCC o L. Monocyt.. 4b ATCC b) Semicuantitativo >10 col. en Oxford o PALCAM Colonias de gris a negro con halo negro + E.coli ATCC u 8739 b) + E. faecalis ATCC ó b) Selectividad 24 h/ 30ºC E. coli ATCC ó 8739 b) Semicuantitativo E. faecalis ATCC ó Inhibición total en TSA <100 colonias en TSA

19 PRT Página 19 de 25 Tabla 3 s de enriquecimiento selectivos (continuación) Norma Función Incubación Cepas Fraser L Listeria monocytogenes EN ISO Productividad 48 h/ 37ºC L. monocyt. 1/2a ATCC o L. Monocyt. 4b ATCC b) + E. coli ATCC ó 8739 b) +E.faecalis ATCC ó b) Semicuantitativo >10 col. en Oxford o PALCAM Colonias de gris a negro con halo negro Selectividad 24 h 48 h/ 37ºC E. coli ATCC u 8739 b) Semicuantitativo Inhibición total en TSA E. faecalis ATCC ó <100 colonias en TSA ITC L Yersinia enterocolitica ISO Productividad 48 h/ 25ºC Y. enterocolitica ATCC ó 9610 b) + E. coli ATCC ó 8739 b) +Ps. aeruginosa ATCC b) Semicuantitativo >10 col. en CIN o SSDC Colonias según cada medio (ver norma) Selectividad 48 h/ 25ºC Ps. aeruginosa ATCC b) P. mirabilis ATCC Semicuantitativo Inhibición total en TSA Park & Sanders L Campylobacter ISO Productividad Ver norma C. coli ATCC 43478* o C.jejuni ATCC ó 29428* +E. coli ATCC u 8739 b) Semicuantitativo >10 col. en medio Karmali u otro medio elegido Colonias según cada medio (ver norma) +P. mirabilis ATCC b)

20 PRT Página 20 de 25 Norma Función Incubación Cepas Selectividad Ver norma E. coli ATCC u 8739 b) P. mirabilis ATCC Semicuantitativo Inhibición total en TSA Preston L Campylobacter ISO Productividad 18 h/ 42ºC C. coli ATCC b) o C. jejuni ATCC ó b) + E. coli ATCC u 8739 b) +P. mirabilis ATCC b) Semicuantitativo >10 col. en medio Karmali u otro medio elegido Colonias según cada medio (ver norma) Selectividad 18 h/ 42ºC E. coli ATCC u 8739 b) P.mirabilis ATCC Semicuantitativo Inhibición total en TSA Tabla 3 s de enriquecimiento selectivos (continuación) Norma Función Incubación Cepas PSB L Yersinia enterocolitica ISO Productividad 35 días/ 25ºC Y. enterocolitica ATCC ó 9610 b) + E. coli ATCC ó 8739 b) +Ps. aeruginosa ATCC b) Semicuantitativo >10 col. en CIN o SSDC Colonias según cada medio (ver norma) Selectividad 35 días/ 25ºC Ps. aeruginosa ATCC b) P.mirabilis ATCC Semicuantitativo Inhibición total en TSA

21 PRT Página 21 de 25 Norma Función Incubación Cepas MKTTn L Salmonella ISO 6579 Productividad 24 h/ 37ºC S. typhimurium ATCC b) Rappaport Vassiliadis o S. enteritidis ATCC b) +E.coli ATCC u 8739 b) +Ps. aeruginosa ATCC b) Semicuantitativo Selectividad 24 h/ 37ºC E. coli ATCC u 8739 b) Semicuantitativo E.faecalis ATCC ó L Salmonella EN Productividad 24 h/ 41,5ºC S. typhimurium ATCC b) o S. enteritidis ATCC b) +E. coli ATCC u Ps.aeruginosa ATCC Semicuantitativo Selectividad 24 h/ 41,5ºC E. coli ATCC u 8739 b) Semicuantitativo E. faecalis ATCC ó >10 col. en XLD u otro medio de elección Inhibición total en TSA <10 col. en TSA >10 col. en BGA u otro medio de elección Inhibición total en TSA <10 col. en TSA Colonias según cada medio (ver norma) Colonias según cada medio (ver norma) RVS L Salmonella ISO 6579 Productividad 24 h/ 41,5ºC S. typhimurium ATCC o S. enteritidis ATCC b) +E.coli ATCC ó 8739 b) Semicuantitativo >10 col. en XLD u otro medio de elección Colonias según cada medio (ver norma) +Ps.aeruginosa ATCC 27853*

22 PRT Página 22 de 25 Norma Función Incubación Cepas Selectividad 24 h/ 41,5ºC E.coli ATCC u 8739 b) Semicuantitativo Inhibición total en TSA E.faecalis ATCC ó <10 col. en TSA Selenitocistina L Salmonella EN Productividad 24 h/ 37ºC S. typhimurium ATCC b) o S. enteritidis ATCC b) +E.coli ATCC u 8739 b) Semicuantitativo >10 col. en BGA u otro medio de elección Colonias según cada medio (ver norma) +Ps.aeruginosa ATCC b) Selectividad 24 h/ 37ºC E.coli ATCC u 8739 b) Semicuantitativo E.faecalis ATCC ó <100 colonias en TSA a) L = medio líquido. b) Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mínimo). Tabla 4 s de enriquecimiento no selectivos Norma Función Incubación Cepas BHI L a) Staphylococcus ISO 6888 Productividad 24 h/ 37ºC S. aureus ATCC b) Cualitativo Turbidez de 1 a 2 Brucella L Campylobacter ISO Productividad 25 días/ 25ºC C. coli ATCC Cualitativo Turbidez de 1 a 2

23 PRT Página 23 de 25 Peptona salina Thioglicolat o L L Líquidos de dilución Clostridium perfringens TSYEB L Listeria monocytogenes ISO 6887 Diluyente 45 min/ 20ºC25ºC ISO 7937 (NCh3061) C. jejuni ATCC ó b) E. coli ATCC ó 8739 b) S. aureus ATCC TSA Cuantitativo ± 50% col./t0 (±50% del recuento original Productividad 24 h/ 37ºC Cl. perfringens ATCC b) Cualitativo Turbidez de 1 a 2 ISO Productividad 24 h/ 25ºC L. monocyt. ½ a ATCC L. monocyt. 4b ATCC b) Cualitativo Turbidez de 1 a 2 a) = L medio líquido. b) Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mínimo). Tabla 5 s de aislamiento selectivos Norma Función Incubación Cepas Método de Butzler modificado CCDA Karmali Preston S a) Campylobacter ISO Productividad 24 h 72 h/ 42ºC C. coli ATCC Cualitativo Buen crecimiento (2) C. jejuni ATCC ó b) Colonias según cada medio (ver norma)

24 PRT Página 24 de 25 Norma Función Incubación Cepas Método de Skirrow Selectividad 24 h 72 h/ 42ºC E. coli ATCC u 8739 b) Cualitativo Inhibición total o parcial (01) Colonias no S. aureus ATCC Inhibición total (0) CIN S Yersinia enterocolitica ISO Productividad 24 h/ 30ºC Y. enterocolitica ATCC Cualitativo Buen ó 9610 b) crecimiento (2) SSDC Selectividad 24 h/ 30ºC E. coli ATCC u 8739 b) Cualitativo Inhibición total o parcial (01) Agar verde brillante (BGA) S Salmonella EN 12824/ ISO 6579 Productividad 24 h 48 h/ 37ºC S. aureus ATCC Inhibición total (0) S. typhimurium ATCC b) Cualitativo Buen crecimiento (2) Colonias caracteristicas según cada medio (ver norma) Colonias no Colonias según cada medio (ver norma) S. enteritidis ATCC XLD Selectividad 24 h 48 h/ 37ºC E. coli ATCC u 8739 b) Cualitativo Inhibición total o parcial (01) Colonias no E. faecalis ATCC ó Inhibición total (0) a) S = medio sólido.

25 PRT Página 25 de 25 Norma Función Incubación Cepas Método de b) Cepas a emplear por el laboratorio usuario (mínimo). Tabla 6 s de aislamiento no selectivos Norma Función Incubación Cepas Método de Agar nutritivo S a) Enterobacteriaceae ISO 7402 ISO 8523 Productividad 24 h/ 37ºC E. coli ATCC u 8739 c) Cualitativ o Buen crecimiento (2) Salmonella EN ISO h/ 37ºC S. typhimurium ATCC c) Yersinia enterocolitica ISO h/ 30ºC Y. enterocolitica ATCC ó 9610 c) Agar TSYEA S Listeria monocytogenes EN ISO Productividad 24 h/ 37ºC L. monocyt. ½a ATCC 1911 ó Cualitativ L. Monocyt. 4b ATCC b) o Buen crecimiento (2) a) S = sólido. b) Cepas a emplear por el laboratorio (mínimo). c) Cepas de libre elección según el método utilizado.