PROCEDIMIENTO METODO DE RECUENTO EN PLACA DIRECTO STAPHYLOCOCCUS AUREUS BAM ON LINE 2001

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1 PRT Página 1 de OBJETIVO Detectar el número de unidades formadoras de colonias (ufc.) de S. aureus presentes en muestras de alimentos y agua 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento para 2.1. Analizar alimentos y agua en los cuales se espera un recuento > 100 células /g o ml 3. FUNDAMENTO Los Staphylococcus son microorganismos que viven en estrecha relación con el hombre y la gran mayoría de las cepas son potencialmente capaces de causar enfermedad. Staphylococcus aureus es un microorganismo fácilmente destruido por tratamientos térmicos con altas temperaturas y por todos los agentes sanitizantes. Por lo cual la presencia de esta bacteria o sus toxinas en alimentos procesados o en equipos, generalmente indica falta de sanitización o contaminación cruzada. Los alimentos se analizan para pesquisar S.aureus por las siguientes razones: Confirmar que este microorganismo fue el agente causal de la intoxicación alimentaria. Determinar qué alimentos o ingredientes de alimentos son fuente de contaminación de Staphylococcus aureus. Demostrar contaminación post proceso los cuales usualmente se deben a contacto humano con alimentos procesados o exposición del alimento a superficies inadecuadamente sanitizadas. Los alimentos comúnmente asociados a intoxicaciones son: carne (vacuno, cerdo, pollo), productos cárneos (jamón, salame, vienesas),ensaladas (papas, porotos verdes, jamón, pollo), productos de pastelería (cremas) y productos lácteos (queso, queso de cabra,etc)

2 PRT Página 2 de REFERENCIAS 4.1 Bacteriological Analytical Manual Online Enero Técnica de coagulasa en tubo PRT Prueba de termonucleasa en cepa de S. aureus PRT TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 MATERIALES Pipetas bacteriológicas de 1 ml.graduadas en 0,1.estériles Rastrillos de vidrio o de plástico autoclavable estériles, de 3-4 mm de diámetro, cm de largo con ángulo de diseminación de mm Placas Petri de vidrio o desechables de mm estériles Tubos de 13 x 100 mm con tapa rosca, estériles 6.2 EQUIPOS Estufa de incubación regulada a 35 º C ± 1ºC Agitador de tubos 6.3 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS Agar Baird Parker ph 6,8-7,0 distribuido en Frascos Schott con 475 ml (o medio completo plaqueado) Solución yema de huevo 50% Telurito de potasio al 1% (se puede utilizar solución yema de huevo comercial con telurito de potasio) Solución sulfametazina 0,1% (opcional para inhibir desarrollo Proteus) Agar soya tripticasa ph 7,3 ± 0.2

3 PRT Página 3 de Caldo infuso cerebro corazón ph 7,4 ± 0.2 en tubo tapa rosca de 13x100 mm Plasma de conejo con EDTA o plasma fresco diluido 1:3 con agua destilada estéril.(usar preferentemente plasma comercial) Agar T B-DNA agar triptona extracto de levadura M 165 BAM para preparar agar glucosa y agar manitol Lisostafina Aceite mineral estéril Peróxido de hidrógeno al 3% Agar conservacion de cepas ph 7,2 en tubo 10x75 mm Cepa control coagulasa positiva: S. aureus Cepa control coagulasa negativa: S. epidermidis 7. DESARROLLO 7.1 RECEPCIÓN DE LA MUESTRA EN EL LABORATORIO Recibir en el Laboratorio de Recuentos, las muestras procesadas en el Laboratorio de Recepción de Muestras (dilución 10-¹ ) según PRT Anotar en cuaderno de inscripción, número de las muestras a sembrar y la clave interna Identificar 3 placas Petri con número, dilución de la muestra y clave interna Marcar en cada dilución el volumen a sembrar en cada una de las placas Petri : 0,3 0,3 y 0,4 Ml De cada dilución transferir 1 ml de suspensión a tres placas de agar Baird Parker distribuyendo 1 ml equitativamente en las tres placas (0,3, 0,3 y 0,4 ml) Extender el inóculo mediante rastrillo estéril, hasta que la superficie esté seca. Retener las placas en posición no invertida hasta que el inóculo se absorba ( aprox 10 minutos) Si el inóculo no está completamente absorbido dejar las placas sin invertir en la incubadora por 1 hora. Incubar las placas invertidas a 35 º C durante horas. 7.2 LECTURA Y REGISTRO

4 PRT Página 4 de Recuento Presuntivo Seleccionar las placas que contengan entre colonias Realizar recuento de todas las colonias circulares, brillantes, convexas, de 2-3 mm de diámetro, de color negro azabache o gris oscuro, con margen claro (blanco), rodeado por zona opaca y fuera de ella una zona clara, de consistencia cremosa cuando son tocadas con el asa de inoculación. Ocasionalmente en varios alimentos y productos lácteos pueden encontrarse cepas de apariencia similar a S. aureus no lipolíticas, salvo que las zonas claras y opacas alrededor de la colonia están ausentes. Cepas aisladas de productos deshidratados o congelados almacenados por largos períodos desarrollan colonias menos negras que las colonias típicas y pueden desarrollar apariencia rugosa y textura seca Anotar el recuento obtenido en cada tipo de colonia y dilución en el "Registro análisis de nuestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos" Código RG Recuento presuntivo = Lectura x Factor de dilución Registro Si son observados muchos tipos de colonias con apariencia similar a S. aureus en todas las placas sembradas, registre el número de colonias contadas de cada tipo separadamente Cuando placas de diluciones bajas tienen < 20 colonias, use este valor Si las placas contienen > 200 colonias de apariencia típica y en diluciones más altas no hay colonias típicas, utilizar estas placas para el recuento y no cuente las colonias no típicas Seleccionar más de una colonia ( 3 a 5) para cada tipo de colonia contada y realizar test de coagulasa y termonucleasa. 7.3 PRUEBAS CONFIRMATIVAS Estudiar las colonias o un número significativo de ellas si el recuento es alto. El test de producción de coagulasa es específico para la especie. Se pueden realizar otras pruebas auxiliares como, catalasa, utilización anaeróbica de glucosa, utilización anaeróbica de manitol, nucleasa termoestable, sensibilidad a la lisostafina. La termonucleasa es tan específica como la coagulasa pero menos subjetiva y es muy útil para complementar y confirmar los test de coagulasa registrados con lecturas de 3+, 2+ y 1+.

5 PRT Página 5 de Ensayo de coagulasa en tubo. Aplicar PRT Producción de nucleasa termoestable. Aplicar PRT EXPRESION DE RESULTADOS Según la proporción de colonias coagulasa positivas calcular el número de ellas por gramo de la muestra. 7.5 CALCULO Recuento de S. aureus = Rto presuntivo X Nº de colonias confirmadas Nº de colonias repicadas 7.6 INFORME Se expresa en ufc de S. aureus por g o ml de producto analizado 8. REGISTROS Identificación del registro Registro control de Ambiente código RG Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis Laboratorio 346 código RG Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición Archivador verde Registros Laboratorio N 346 Sección Archivador verde Registros Laboratorio N 346 Sección Acceso restringido al personal Sección Acceso restringido al personal Sección Papel Papel 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos

6 PRT Página 6 de 13 Identificación del registro Registro análisis de muestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos código RG Registro de entrega diaria de muestras a los laboratorios código RG- Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención y disposición Archivador azul Registro de Lecturas e informes de resultado de laboratorio Recuento aerobios mesófilos, S. aureus,mohos y levaduras Sección Archivador Registros Entrega diaria Laboratorio N 346 Sección Acceso restringido al personal Sección Acceso restringido al personal Sección Papel Papel 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio 3 1 Se elimina página 1 por cambió en formato documento institucional. 3 1 a 10 Se cambió formato del encabezado de página en todo el documento. Fecha Aprobación Se corrige PRT por PRT Se cambió número de revisión por 3 por revisión N 4 y el total de páginas. 3 1 En el punto 1 se agregó... en muestras de alimentos y agua.

7 PRT Página 7 de 13 Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobación 3 1 En la frase del punto 2.1 se agregó:... y agua...se espera un recuento Se deja pie de página sólo en página 1 y se actualizan los cargos. 3 1 En el punto 3. se corrigió staphylococcus por Staphylococcus 3 2 En el punto 4.2. se corrigió PRT por PRT En el punto 4.3 se corrigió PRT por PRT En el punto 6.0 se agregó al listado : solución de yema de huevo al 50%, solución telurito de potasio 1%,( se puede utilizar solución yema de huevo comercial con telurito de potasio),solución de sulfametazina 0,1% (opcional para inhibir el desarrollo de Proteus), lisostafina y aceite mineral estéril. En el punto plasma s eagregó...(usar preferentemente comercial). En el punto Baird Parker se agregó...(o medio completo plaqueado). 3 4 En el punto se cambió PRT por PRT En los puntos y se agregó... y clave interna. 3 4 En el punto se corrigió ml por ml. 3 4 En el punto se eliminó la palabra plaqueada 3 4 En el punto se agregó la frase:.. el inóculo En el punto se agregó : en varios alimentos y productos lácteos pueden encontrarse cepas de apariencia similar a S. aureus no lipolíticas, salvo que las zonas claras y opacas alrededor de la colonia están ausentes. 3 4 En el punto se cambió RG por RG Se agregó el punto Registros y lo ítemes

8 PRT Página 8 de 13 Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio al En el punto se agregó: El test de producción de coagulasa es específico para la especie sensibilidad a la lisostafina. La termonuclesa es tan específica como la coagulasa pero menos subjetiva y es muy útil para complementar y confirmar los test de coagulasa registrados con lecturas de 3+, 2+ y En los puntos y se cambío por PRT y PRT por PRT y PRT respectivamente. 3 5 Se cambió el punto 8. 0 RESPONSABLES por REGISTROS. 3 5 Se cambio el punto 9.0 DISTRIBUCION por TABLA DE MODIFICCAIONES 3 6 En el punto 10.1 se cambió RG por RG En el punto 10.2 se cambió RG por RG En el punto 10.3 se cambió RG por RG En el punto 10.4 se cambió RG por RG Se agregó tabla de registros 3 6 El punto 10.0 REGISTROS se cambió a ANEXOS y sus ítemes Se modificó anexo N 3 en Primera viñeta:... almacenado hasta 1 mes en refrigeración. Fecha Aprobación Segunda viñeta: - si se ha almacenado a temperatura ambiente

9 PRT Página 9 de 13 Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobación (20 C a 25 C ) por más de 5 días. -si el medio plaqueado ha perdido la opalescencia inicial Se agregó hoja anexo N 5 RG En ítem solución stock sulfametazina se corrigió Proteus por Proteus sp. 10. ANEXOS Anexo N 1 Esquema recuento S. aureus Técnica Recuento en placa por siembra en superficie. Anexo N 2 Caracterización de los diferentes medios de cultivo utilizados para la detección de S. aureus en alimentos. Anexo N 3 Precauciones en la preparación del medio Baird Parker. Anexo N 4 Secado de placas con agar Baird Parker. Anexo N 5 Hoja Registro análisis de muestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos código RG

10 PRT Página 10 de 13 ANEXO Nº 1 RECUENTO S. AUREUS TECNICA RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN SUPERFICIE HOMOGENEIZADO: 1 ml 10 g muestra 9 ml AP 90 ml Agua peptonada 0.1% Dil SIEMBRA : 0,3 ml 0,3 ml 0,4 ml 0,3 ml 0,3 ml 0,4 ml 0,3 ml 0,3 ml 0,4 ml Agar Baird Parker INCUBACION: 35 ºC por 48 horas LECTURA PLACAS : Lectura de placas que contengan entre 20 a 200 ufc Colonia, negra con características de S. aureus REAISLAMIENTO : Pruebas bioquímicas o toxinas caldo cerebro corazón Incubar a 35 º C por 24 hrs Agar estría CONFIRMACION : Prueba coagulasa en tubo Plasma de conejo Prueba de termonucleasa Agar TB-DNA

11 PRT Página 11 de 13 INCUBACION: Incubar a 35 ºC por Incubar en cámara húmeda 4-18 horas a 35 ºC por 4 hrs LECTURA PRUEBAS Leer a las 4hrs, los tubos Leer a las 4hrs CONFIRMATIVAS negativos incubar hasta 18 hrs CÁLCULO INFORME Contar el Nº de tubos positivos de cada dilución, hacer el cálculo según tubos confirmados Informar como Nº de UFC/g o ml de producto

12 PRT Página 12 de 13 ANEXO Nº 2 CARACTERIZACION DE LOS DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA LA DETECCION DE S. AUREUS EN ALIMENTOS Medios de cultivo Incubación Agentes selectivos diferenciales y estimulantes Tiempo Temp hrs ºC KRANEP Cloruro de sodio cloruro de Litio Rodanuro de potasio Azida de sodio Cicloheximida Manitol Piruvato de sodio Yema de huevo BAIRD PARKER Cloruro de litio Telurito de potasio Glicina Piruvato de sodio Yema de huevo TPEY Cloruro de sodio Cloruro de Litio Telurito de potasio Polimixina B Yema de huevo AGAR SANGRE Polimixina B POLIMIXINA Sangre de cordero P-CSTS * Cloruro de sodio Piruvato de sodio * P-CSTS: Caldo soya tripticasa con 10% NaCl y 1 % piruvato de sodio Lectura Colonias amarillas que degradan la yema de huevo Colonias negras o grises brillantes, convexas rodeadas por un halo de precipitación o áreas claras. Colonias negras o grises brillantes, convexos, rodeadas por la reacción yema de huevo. Colonias que presentan halos de hemólisis tipo β Turbidez

13 PRT Página 13 de 13 ANEXO Nº 3 PRECAUCIONES EN LA PREPARACION DEL MEDIO BAIRD PARKER El medio base puede ser almacenado hasta 1 mes en refrigeración. El medio completo no debe usarse: - si se ha almacenado a temperatura ambiente (20 C a 25 C ) por más de 5 días. - si el medio plaqueado ha perdido la opalescencia inicial. En períodos prolongados de almacenamiento del medio deshidratado se reduce la selectividad. Este efecto puede ser revertido por adición de 0,5 ml de piruvato de sodio al 20% p/v en la superficie del medio de cultivo plaqueado y dejar secar a 50ºC por 1/2 hora o hasta que la superficie de la placa esté seca. Realizar control de calidad utilizando el método ecométrico a cada partida de medio preparado (IT ). Solución stock de sulfametazina Disolver 0,5 g de sulfametazina en 25 ml de Hidróxido de sodio 0,1 N. Enrasar a 250 ml con agua destilada. 27,5 ml de esta solución aportan 0,055 g. Adicionar la solución de sulfametazina para reprimir el crecimiento de Proteus. ANEXO Nº 4 SECADO DE PLACAS CON AGAR BAIRD PARKER Las placas a usar deben estar secas a fin de prevenir la extensión y mezcla de colonias. El secado de las placas se puede efectuar colocando las placas: En un horno o incubadora a 50 º C por 30 minutos, quitando la tapa y colocando la superficie del agar hacia abajo. En un horno o incubadora a 50 ºC por 2 horas con la tapa puesta y la superficie del agar hacia arriba. En una incubadora a 37 º C por 4 horas con la tapa puesta y la superficie del agar hacia arriba. En la mesa del laboratorio por cerca de 16 horas a la temperatura ambiente, con las tapas puestas y la superficie del agar hacia arriba.

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