Aislamiento de Microorganismos Diversidad Metabólica

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1 Trabajo Práctico Nº4 Aislamiento de Microorganismos Diversidad Metabólica

2 Objetivo del Trabajo Práctico Aislamiento de microorganismos partir de distintos inóculos 1)Enriquecimiento-Selección 2)Selección-Diferenciación 3)Obtención de un cultivo puro (Tinción de Gram y Pruebas Bioquímicas)

3 Microorganismos a aislar: Enterobacterias (agua) Pseudomonas spp. (agua) Staphylococcus spp. (ricota) Bacillus spp. (arroz) Lactobacillus spp. (yogurt) Azotobacter spp. (tierra)

4 Medios de Cultivo: características generales Disponibilidad de nutrientes (C, N, sales inorgánicas, vitaminas) Disponibilidad de oxígeno ph Humedad Temperatura Esterilidad

5 Medios Definidos o Complejos Medios Mínimos (definidos) o Ricos (complejos).

6 Medio Definido: los componentes del medio (y sus concentraciones) son conocidos. Ejemplo de Medio Definido para Escherichia coli: Glucosa Componente Na 2 HPO 4 Gramos/litro 5 6 Fuente de C y energía Buffer, fuente de P KH 2 PO 4 3 Buffer, fuente de P NH 4 Cl 1 Fuente de N NaCl 0.5 Fuente de Na MgSO 4 7H 2 O 0.12 Fuente de Mg CaCl 2 2H 2 O 0.01 Fuente de Ca

7 Medio Complejo: se agregan ingredientes cuya composición exacta de desconoce (extractos, peptonas, etc). Ejemplo de Medio Complejo para Salmonella: Componente Extracto de carne Peptona Glucosa Gramos/litro Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y micronutrientes. También fuente de C. Fuente de aminoácidos, nucleótidos, vitaminas y micronutrientes. También fuente de C. Fuente de C y energía. Na 2 HPO 4 12H 2 O FeSO 4 7H 2 O Indicador Sulfito de Bismuto Verde Brillante Buffer y fuente de P. Indicador de producción de H 2 S. Fuente de Fe y S. Inhibe el crecimiento de Gram positivos Inhibe el crecimiento de Gram positivos Ágar 20

8 Peptonas: derivados hidrosolubles de la digestión de proteínas Peptona de caseína (triptona): degradación pancreática de la caseína. Peptona de carne: degradación pancreática de la carne. Peptona de gelatina: degradación pancreática de la gelatina. Proteosa peptona: peptona de mayor calidad, con alta proporción de péptidos de menor PM, aminoácidos libres y factores de crecimiento. Extracto de levadura: derivados hidrosolubles de la levadura autolisada. Alto contenido de vitaminas.

9 Medio Mínimo: posee la mínima cantidad de nutrientes requeridos para el crecimiento. Es un medio definido. Por ej.: M9. Medio Rico: posee gran variedad de nutrientes y en abundancia (provenientes de extractos y peptonas). Por lo general son medios complejos. Por ej: Luria-Bertani (LB): Componente Triptona Extracto de Levadura NaCl Gramos/litro Aminoácidos, carbono, energía, macro y micronutrientes. Vitaminas, macro y micronutrientes. Balance osmótico.

10 Medio de Enriquecimiento: se utiliza como primer paso en el aislamiento de bacterias. Contiene sustancias que permiten enriquecer el cultivo en el organismo de interés. Medio Selectivo: posee sustancias que permiten el crecimiento de un grupo de bacterias y que inhiben el desarrollo de otros grupos. Por ej.: sales biliares y cristal violeta: inhiben el crecimiento de Gram positivos. Medio Diferencial: contiene compuestos que permiten detectar algún cambio de color en el medio cuando ocurre una determinada reacción química. Por ej: azul de bromocresol: indicador que vira al amarillo cuando el ph del medio es ácido (permite distinguir a las bacterias que fermentan lactosa). Medio Selectivo y Diferencial.

11 Pasos a seguir para aislar un microorganismo (y caracterizarlo): 1. Inocular la muestra (agua, tierra, yogurt, ricota o arroz) en un caldo de enriquecimiento. 2. Incubar a la temperatura y tiempo adecuados. 3. Estriar en medio selectivo (además puede ser diferencial). Obtención de colonias aisladas. 4. Tinción de Gram 5. Pruebas Bioquímicas: TP Nro. 5.

12 Enterobacterias γ-proteobacteria Bacilos Gram negativos Fermentadores de glucosa Anaerobios facultativos Flagelos peritricos Escherichia coli (algunas cepas patógenas) Salmonella, Shigella, Enterobacter, Yersinia, Klebsiella, Proteus, entre otros. Todos con especies patógenas.

13 Aislamiento de Enterobacterias (agua) 1. Sembrar en Caldo Mac Conkey (2x): medio de enriquecimiento y selectivo para el aislamiento de enterobacterias de agua y leche. Peptona de Caseína Lactosa Bilis de Buey Púrpura de Bromocresol ph= 7,4±0,2 Incubar por 48 hs a 37ºC Si hay fermentación de lactosa el medio se acidifica y el color cambia a amarillo. Sólo ácido Gas + ácido Coliformes, sin E. coli E.coli (junto a otras coliformes)

14 Aislamiento de Enterobacterias (agua) Crecimiento en Caldo Mac Conkey Cambio de color a amarillo Formación de Gas Escherichia coli Bueno Sí Sí (lactosa +) Enterobacter cloacae Bueno Sí Sí (lactosa +) Klebsiella pneumoniae Bueno Sí Sí (lactosa +) Proteus mirabilis Bueno No No (lactosa -) Staphylococcus aureus Malo Si hay formación de gas y el ph del medio se acidifica, entonces, el siguiente paso es estriar en ágar Mac Conkey y ágar EMB.

15

16 Problemas

17 Aislamiento de Enterobacterias (agua) 2. Ágar Mac Conkey: medio selectivo y diferencial. Peptona de Caseína Peptona de Carne Cloruro de Sodio Lactosa Sales biliares Cristal violeta Rojo Neutro ph= 7,1±0,1 Incubar por 24 hs a 37ºC Apariencia de las colonias Grandes, rojas, con halo Grandes, rosadas, mucoides Incoloras, transparentes Pequeñas, opacas, aisladas Microorganismo Escherichia coli (lactosa +) Enterobacter spp., Klebsiella spp. (lactosa +) Salmonella spp., Shigella spp., Proteus spp. Enterococci, Staphylococci

18 Ágar Mac Conkey Lactosa + Lactosa - Escherichia coli Salmonella typhimurium

19 Aislamiento de Enterobacterias (agua) 2. Ágar EMB: medio selectivo y diferencial (enterobacterias patógenas). Peptona de Carne Hidrógenofosfato dipotásico Lactosa Sacarosa Eosina Amarillenta Azul de Metileno ph=7,0±0,2 Incubar por 24 hs a 37ºC Apariencia de las colonias Transparentes, de color ámbar Verdosas con brillo metálico a la luz reflejada, con el centro negroazulado a la luz transmitida Más grandes que las de E. coli, mucosas, confluentes, con el centro pardo-grisáceo a la luz transmitida Microorganismo Salmonella spp., Shigella spp. Escherichia coli (lactosa +, sacarosa +) Enterobacter spp., Klebsiella spp. (lactosa+, sacarosa-)

20 Ágar EMB Lactosa + Lactosa + Escherichia coli Enterobacter spp.

21 Ágar EMB (A) Escherichia coli, (B) Pseudomonas aeruginosa, (C) Klebsiella pneumoinae, y (D) Enterobacter aerogenes

22 Pseudomonas spp. γ-proteobacteria Bacilos Gram negativos Aerobios estrictos Con flagelos polares Producen pigmentos No fermentadores Patógenos de plantas/infecciones oportunistas en humanos

23 Aislamiento de Pseudomonas aeruginosa (agua) 1. Sembar en Caldo M9 e incubar por 48 hs a 42ºC: enriquecimiento y selección. 2. Estriar en Ágar Cetrimida: medio selectivo para Pseudomonas aeruginosa Peptona de Gelatina MgCl 2 Cetrimida Glicerina SO 4 K 2 Incubar por 48 hs a 37ºC. Pseudomonas aeruginosa

24 Staphylococcus spp. Cocos Gram positivos Anaerobios facultativos Fermentan glucosa (ac. láctico) Asociados a piel y mucosas Patógenos (S. aureus) Resisten altas concentraciones salinas

25 Aislamiento de Staphylococcus aureus (ricota) 1. Ricota en Agua Peptonada: 2 hs a temperatura ambiente 2. Mezclar con Caldo Cerebro Corazón 2X (con NaCl 13%): medio selectivo y deenriquecimiento para Estafilococos patógenos. Infusión de cerebro Infusión de corazón Proteosa peptona D(+) Glucosa NaCl (6.5% final) Hidrógenofosfato disódico ph=7,4±0,2 Incubar por 48 hs a 37ºC Si hay crecimiento, estriar en Ágar manitol salado-rojo fenol y Ágar azida

26 Aislamiento de Staphylococcus aureus 3. Ágar manitol salado-rojo fenol: medio selectivo y diferencial (permite distinguir entre S. aureus y otras especies no patógenas). Peptona de carne Extracto de carne NaCl 6.5% D(-)Manitol Rojo fenol ph=7,4±0,2 Incubar por 48 hs a 37ºC Apariencia de las colonias Con halo amarillo, luminoso; crecimiento intenso Sin cambio de color; poco crecimiento Microorganismo Manitol-positivos: S. aureus Manitol-negativos: S. epidermidis y otros. 3. Ágar azida: medio selectivo para Staphylococcus spp. Incubar por 48 hs a 37ºC S. epidermidis S. aureus

27 Bacillus spp. Bacilos Gram positivos Forman endosporas Generalmente móviles con flagelos peritricos Aerobios (facultativos) B. cereus (alimentos) B. anthracis

28 Aislamiento de Bacillus cereus y Bacillus subtilis (arroz) 1. Arroz en PBS (80ºC por 5 min.): selección. 2. Pasar el sobrenadante a caldo nutritivo: enriquecimiento. 3. Incubar por 48 hs a 37ºC. 4. Estriar en Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo: selectivo y diferencial (permite distinguir entre Bacillus cereus y B. subtilis) Peptona de carne Extracto de carne D(-)Manitol NaCl Rojo Fenol Emulsión de yema de huevo/polimixina B Incubar por 48 hs a37ºc. Bacillus cereus: colonias rugosas, secas, de color rosado y rodeadas de precipitado blanco (Manitol y lecitinasa +). Bacillus subtilis: colonias amarillas y sin precipitado (Manitol + y lecitinasa -).

29 Lactobacillus spp. Bacilos o cocobacilos Gram positivos Fermentadores lácticos Aerobios facultativos o microaerófilos

30 Aislamiento de Lactobacillus spp. (yogurt) 1. Ágar De Man, Rogosa y Sharpe (MRS): medio de enriquecimiento selectivo. Acetato de sodio, Tween 80. ph = 5.7 Incubación en microaerobiosis. 2. Ágar Rogosa: medio más selectivo que el anterior, con mayores concentraciones de acetato, citrato de amonio y ph=5.5 que inhiben flora acompañante. Incubación en microaerobiosis. Ágar MRS-Lactobacillus casei

31 Azotobacter spp. Bacilos o cocos Gram negativos Habitan en el suelo y en el agua Fijan nitrógeno atmosférico (N 2 a NH 3 ) Vida libre Forman quistes (similar a endosporas) Medio Fred & Waksman: medio selectivo sin fuente de nitrógeno. Contiene manitol (azúcar fermentable). Crecimiento a 28ºC.

32 Microorganismo Enriquecimiento -Selección Selección- Diferenciación Agua Enterobacterias Caldo Mc Conkey Ágar Mc Conkey y ágar EMB Agua Pseudomonas Caldo M9-42ºC Ágar Cetrimida Ricota Staphylococcus Caldo cerebrocorazón con 6.5% NaCl Ágar manitol salado rojo fenol y ágar azida Arroz Bacillus 80ºC y caldo nutritivo Ágar Mossel con emulsión de yema de huevo y PmB. Yogurt Lactobacillus Ágar MRS Microaerobiosis Ágar Rogosa Microaerobiosis Tierra Azotobacter Caldo Fred& Waskman-28ºC Ágar Fred & Waskman-28ºC

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