PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR RIBOFLAVINA EN ALIMENTOS. Método Fluorométrico-HPLC

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1 PRT Página 1 de 8 1. OBJETIVO Determinar la concentración de riboflavina por cromatografía liquida de alta resolución en alimentos. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE El método es aplicable a muestras de harinas, productos a base de leche, de cereales, o una mezcla de ambos, enriquecidos o no con vitamina B2 recepcionadas en la Sección Química de. 3. FUNDAMENTO Se basa en la extracción de la riboflavina a través de un tratamiento enzimático, seguido por hidrólisis ácida, filtración por membrana 0,22 micras y posterior identificación y cuantificación de esta por cromatografía liquida isocrática en fase inversa con detector de fluorescencia, ajustada a una longitud de onda de excitación de 450 nm y de emisión de 528 nm 4. REFERENCIAS 4.1. United State Pharmacopeia U.S.P. XIX, pág 441, año Análisis de Vitaminas, Rolf Strobecker and HeinzM. Henning año Methods for the determination of vitamins in food, G. Brubacher Muller Mulot and A.T. Southgate, pág , año1986

2 PRT Página 2 de 8 5. TERMINOLOGÍA Riboflavina: Es una sustancia amarilla fluorescente se encuentra ampliamente distribuida en los reinos vegetal y animal. Se encuentra la forma sintética como Riboflavina 5 -sodio fosfato y corresponde a un grupo de vitaminas solubles en agua que forman parte del grupo de vitaminas del complejo B. La vitamina B2 es sensible a la luz, utilizar material de vidrio marrón o ámbar. 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1. Materiales Columna: C 18 o RP -18 (5 um), 125 x 4,6 mm Dispositivo de filtración sobre membrana Millipore Embudos Espátula Matraz aforado de 1000 ml color ámbar Matraz aforado de 50 ml color ámbar Matraz aforado de 100 ml color ámbar Matraces Erlenmeyer de 250 ml color ámbar Membranas Millipore de 0,22 micras de 13 mm Membranas Millipore de 0,22 micras de 47 mm Navecillas filtro Whatman Nº Peachímetro Pipetas Pre-Columna C 18 o RP -18 (5 um) 4x Equipos Cromatógrafo líquido de alta resolución con bomba cuaternaria o isocrática, detector de Fluorescencia, muestreador automático y sofweare adecuado Balanza analítica sensibilidad 0,1 mg Baño termorregulado con agitación magnética y rango de Tº + 40 ºC a 50 C Baño termorregulado con rango de Tº + 80ºC a 90ºC.

3 PRT Página 3 de Reactivos Ácido clorhídrico (HCL) fumante 37 % p.a Ácido clorhídrico 1 N. En un matraz aforado de 1000 ml que contenga aproximadamente 500 ml de agua destilada, añadir con cuidado 82 ml de HCL al 37%., enrasar con agua destilada N,N Dimetilformamida p.a Hidrogenofosfato de di-potasio p.a. (K 2 HPO 4 3 H 2 O) Solución de Hidrogenofosfato de di-potasio, solución 10 mm ph 7,2. En un vaso de 1000 ml pesar exactamente 2,28 g de K 2 HPO 4 3 H 2 O.y disolver en aproximadamente 800 ml de agua destilada. Ajustar el ph a 7,2 con HCL 1N. Trasvasar a un matraz aforado de 1000 ml y enrasar con agua destilada. Desgasificar bajo presión reducida y filtrar a través de membranas Millipore de 0,22 micras de 47 mm Fase móvil N,N Dimetilformamida, solución al 30% en hidrogenofosfasto de di-potasio. En un matraz aforado de 1000 ml adicionar 300 ml de N,N-dimetilformamida y enrasar con la solución Papaína soluble. p.a Riboflavina estándar almacenada Sodio Acetato trihidratado p.a Solución de acetato de sodio 2,5 M. Pesar 340 mg de g de acetato de sodio trihidratado y llevar a un matraz aforado de 1000 ml con agua destilada y enrasar Takadiastasa Preparación del estándar Riboflavina estándar solución stock o concentrada de 50 µg/ml Pesar en un matraz de color ámbar de 500 ml, exactamente 25 mg de riboflavina estándar, agregar 350 ml de agua destilada a + 60 ºC y 0.6 ml de ácido acético glacial. Agitar hasta que la vitamina B 2 se disuelva por completo. Enfriar y enrasar con agua destilada. Esta solución es estable durante 6 meses a 4 ºC Solución intermedia de 5 ug/ml Diluir 5 ml de la solución anterior en un matraz aforado de color ámbar de 50 ml y aforar con agua destilada Curva de Trabajo de 0,1-0,3-0,5 y 1,0 ug/ml

4 PRT Página 4 de 8 Tomar alícuotas de 1 ml, 3 ml, 5 ml y 10 ml de la solución Solución intermedia de 5 ug/ml y llevar a matraces aforados de 50 ml y enrasar. Filtrar cada solución con membranas Millipore de 0,22 micras de 13 mm. La solución está lista para traspasar a vial HPLC e inyectar. 7. DESARROLLO El ingreso de la muestra para su análisis debe cumplir con el Instructivo de Aceptación o Rechazo de muestras IT Profesional del laboratorio es el encargado de realizar el análisis HPLC, realiza los cálculos e informa resultados. Técnico del laboratorio efectúa el resto del procedimiento La vitamina B2 es sensible a la luz, utilizar material de vidrio marrón o ámbar 7.1. Preparación de la muestra Homogeneizar toda la muestra mezclando o moliendo en caso de ser necesario pasar por tamiz malla 20, pesar y anotar el peso exacto según el tipo de muestra para: Harina para panificación 4 a 5 g Mezcla vitamínica para panificación g Pan g Productos con almidón En un matraz de 100 ml con cuello esmerilado mezclar la muestra con 0,25 g de papaína y 0, 5 g de Takadiastasa. Agregar 15 ml de agua destilada a T + 45 a 50 ºC. Mezclar bien a fin de obtener una suspensión homogénea. Tapar el matraz y colocar durante 30 minutos en un baño con agua y agitación a Tº + 40 ºC a 50ºC. Agregar a continuación 30 ml de agua destilada a T + 45 a 50 ºC Productos sin almidón En un matraz de 100 ml con cuello esmerilado mezclar la muestra con agua destilada a + 45 a 50 ºC. Mezclar bien a fin de obtener una suspensión homogénea Hidrólisis Añadir 5 ml de HCL 1 N al matraz, mezclar bien, calentar por 30 minutos a baño maría hirviente agitando ocasionalmente para evitar aglomerados.

5 PRT Página 5 de Enfriar y añadir 5 ml de acetato de sodio 2,5 M. Mezclar bien y transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml color ámbar y enrazar con agua destilada Filtrar a través de filtro plisado y posteriormente membranas Millipore de 0,22 micras de 13 mm. Traspasar a vial HPLC y la solución esta lista para inyectar. 7.3 Determinación cromatográfica de Riboflavina 7.3.1Curva de calibración de las soluciones estándares Inyectar en triplicado 20 ul de cada uno las soluciones estándares entre 0.1 y 1,0 ug/ml Tiempo de corrida: 5 minutos Realizar la curva de calibración utilizando el método de cálculo con estándar externo integrado en el equipo. 7.4 Condiciones Cromatográficas de Tiamina Columna : C18 o RP-18 (5um) 125 x 4,6mm y Pre Columna RP -18 (5 um) 4-4 Fase móvil : Inyección : 20 ul Flujo o caudal : 0,8 ml / min. Detector : Espectrofluorímetro, Excitación: 450 nm y Emisión 528 nm 7.5 Cuantificación de Riboflavina en muestras Ingresar al HPLC en método Riboflavina que contiene la curva de calibración obtenida de concentración (C) en ug/ml e interpolar la muestra para cuantificar el resultado del área vs concentración. Valor C (ug/ml) Inyectar en duplicado 20 ul de la solución eluida del extracto de la muestra de harina de trigo Tiempo de corrida: 5 minutos.

6 PRT Página 6 de Cálculo e informe de resultados c x v mg /Kg = a Donde: c = concentración en ug/ml obtenidos por la interpolación en la curva de calibración de la muestra. v = volumen de la muestra final a = masa de la muestra en gramos Limite de detección: 0,001 ug/ml Limite de cuantificación: 0,02 ug/ml Informar mg/kg de Riboflavina con un decimal. Control de Calidad Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos realizados con el método analítico recogido en este procedimiento. a) Nivel I: Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia certificados y patrones de referencia certificados, según disponibilidad. b) Nivel III. Durante el desarrollo de la serie de trabajo se incluye: - Control de blanco al inicio de la corrida cromatográfica - Control de estándar de concentración conocida - Inyección del estándar como control por cada diez muestras inyectadas Control de Calidad Se efectuarán controles sistemáticos y periódicos para comprobar la validez de los ensayos realizados con el método analítico recogido en este procedimiento. c) Nivel I: Ensayos de intercomparación, utilización de materiales de referencia certificados y patrones de referencia certificados, según disponibilidad. d) Nivel II: Materiales de referencia sin certificación externa y muestras fortificadas por el analista en la validación. e) Nivel III. Durante el desarrollo de la serie de trabajo se incluye:

7 PRT Página 7 de 8 - Control de blanco al inicio de la corrida cromatográfica - Control de estándar de concentración conocida - Inyección del estándar como control por cada diez muestras inyectadas 8. REGISTROS Identificación del registro Libro de Registro de análisis Vitaminas RG Archivador cromatogramas vitaminas Registro control de T Congelador RG Almacenamiento Protección En estante del Laboratorio Nutrientes, Aditivos y. de En estante Laboratorio Nutrientes, Aditivos y Laboratorio Nutriente En Laboratorio Nutrientes, Aditivos estante y RG En estante Registro de Laboratorio calibración de Nutrientes, peachimetro Aditivos y Base datos En computador computacional del Laboratorio Programa Ministerial de Nutrientes, Harinas Aditivos y Registro de En Estante del temperaturas Laboratorio de refrigeradores RG- Nutrientes, Acceso Restringido Técnico y Profesional de Laboratorio Acceso Restringido Técnico y Profesional Laboratorio Acceso Restringido Técnico y Profesional Laboratorio Acceso Restringido Técnico y Profesional Laboratorio Acceso a Técnico y Profesional Laboratorio de Acceso a Técnico y Profesional Laboratorio de Recuperación Tiempo retención disposición y

8 PRT Página 8 de 8 Identificación del registro Almacenamiento Protección Aditivos y Registro preparación En estante del de soluciones de Laboratorio de estándares puros Nutrientes, RGG Aditivos y Registro preparación En estante del de mezclas de Laboratorio de soluciones Nutrientes, estándares RGG- Aditivos y y Jefatura de sección Acceso a Técnico y Profesional Laboratorio de Acceso a Técnico y Profesional Laboratorio de Recuperación Tiempo retención disposición y 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobación 10. ANEXOS No Aplica

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