PROCEDIMIENTO ENUMERACION DE LEVADURAS Y MOHOS EN ALIMENTOS BAM ONLINE

Transcripción

1 PRT Página 1 de 7 1. OBJETIVO Detectar el número de unidades formadoras de colonias (ufc) de levaduras y de mohos en el alimento 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Aplicar este procedimiento a los alimentos que el Reglamento Sanitario de los indique su análisis. Este procedimiento es recomendable para alimentos en los cuales el ambiente es menos favorable para el crecimiento bacteriano por ejemplo ph <5, baja humedad, aw (0.85), alto contenido en sal o azúcar, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibióticos o exposiciones a irradiación 3. FUNDAMENTO Los mohos y levaduras conforman un amplio y diverso grupo de especies que pueden causar distintos grados de deterioro y descomposición en los alimentos. Pueden crecer e invadir en prácticamente en cualquier alimento, invadir cultivos, como granos, frutos secos, legumbres, deteriorar frutas y hortalizas. La mayoría son aerobios estrictos, desarrollo en rango de ph, temperatura es bastante amplia y pueden crecer en condiciones de actividad del agua (aw) relativamente bajas. La importancia de la presencia de mohos está determinada por la capacidad de producir metabolitos tóxicos conocidos como micotoxinas que son responsables de intoxicación con consecuencias graves (cáncer, mutagénesis,) en los órganos afectados. También están asociados a reacciones alérgicas e infecciones sobretodo en la población inmunocomprometida, en ancianos y niños. 4. REFERENCIAS 4.1 Food and Drug Administration "Bacteriological Analytical Manual", BAM Online, enero 2001, capítulo 18.

2 PRT Página 2 de 7 5. TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Materiales Pipetas estériles de 1, 5 y 10 ml graduadas en 0,1 ml Placas estériles Rastrillos estériles Vaso de precipitado estériles de 300 ml Pinzas Solución de cloro al 10% Agua destilada estéril 6.2 Equipos Incubadora regulada a 25 C ( rango 22 C a 25 C) Baño termorregulado 47 ± 2 C Cuenta colonias tipo Québec Congelador -20 C 6.3 Medios de Cultivo y Reactivos Agar Dicloran Rosa de Bengala (DRBC), existe en forma comercial con el antibiótico incluido Agar Dicloran con glicerol al 18% (DG18), existe en forma comercial con el antibiótico incluido Agar Plate Count con cloranfenicol Agar Malta (MA) Agar Extracto de Malta (MEAYM) Agar Papa Dextrosa (PDA) Solución de Cloranfenicol Solución Clortetraciclina

3 PRT Página 3 de Agua peptonada 0,1% Reactivos tinción de Gram 7. DESARROLLO 7.1 RECEPCIÓN DE LA MUESTRA EN EL LABORATORIO 346: Recibir la muestra previamente homogeneizada en el laboratorio 340 (Recepción de muestras) según el PRT (alícuotas analíticas de g en ml de agua peptonada al 0,1 % y homogeneizado por 2 minutos en Stomacher. Homogeneizados de segundos son eficaces) Disponer de placas con agar DRBC y DG18 previamente solidificado El agar DG18 se requiere cuando la actividad del agua de la muestra es inferior a 0, Efectuar diluciones consecutivas en agua peptonada al 0,1 %. 7.2 SIEMBRA EN PLACA DE AGAR EN SUPERFICIE: Con pipeta estéril sembrar 0,1 ml de cada dilución (mínimo 2 diluciones consecutivas) en triplicado en placas de agar DRBC y/o DG18 según corresponda y previamente solidificados El agar DG18 es recomendable usarlo cuando la actividad del agua de las muestras es < 0,95, ejemplo: cereales, harinas, nueces, especies Diseminar con rastrillo estéril El tiempo transcurrido desde la preparación de la homogeneización inicial a la siembra en placa no debe pasar de los 20 minutos, el tiempo ideal es de 10 minutos Incubar las placas en la oscuridad a 25 C, en pilas de no más de 3 placas y sin invertir por 5 días sin mover La siembra en superficie es más eficiente que en profundidad porque es más precisa para la enumeración debido a que en siembra en profundidad los hongos crecen más rápido y los hongos oscuros crecen por debajo del agar dificultando el recuento. Por lo tanto en superficie el desarrollo es más uniforme Desde la homogeneización inicial a la siembra en placas no debe transcurrir más de 20 minutos, de preferencia 10 minutos es lo ideal Si se requiere aislar colonias individuales utilizar agar PDA o MA para un posterior análisis y para la identificación de especie si es necesaria.

4 PRT Página 4 de 7 NOTA: Los recuentos realizados en siembra en superficie son más precisos que los realizados en siembra en profundidad, por lo tanto la siembra en superficie se considera mejor que en profundidad. 7.3 SIEMBRA EN PLACA DE AGAR EN PROFUNDIDAD Medir con pipeta estéril 1 ml de la dilución (mínimo 2 diluciones consecutivas) y verter en placa de Petri de 15 x 100 mm La siembra en triplicado Añadir inmediatamente 20 a 25 ml de agar DG18 mantenido a 47 ± 2 C No debe tardar más de 1 a 2 minutos desde el inóculo de la dilución a la placa para agregar el agar, para evitar la adhesión de la muestra en la placa, especialmente si la muestra es rica en almidón y las placas son desechables No se recomienda utilizar agar DRBG para siembra en profundidad, sólo para superficie Mezclar suavemente el contenido con 5 movimientos en dirección de las agujas del reloj, 5 movimientos el línea vertical, 5 movimientos en dirección contraria a las agujas del reloj y finalmente 5 movimientos en línea horizontal Desde la homogeneización inicial a la siembra en placas no debe transcurrir más de 20 minutos, de preferencia 10 minutos es lo ideal Incubar las placas en la oscuridad a 25 C, en pilas de no más de 3 placas y sin invertir por 5 días sin mover Si se requiere aislar colonias individuales utilizar agar PDA o MA para un posterior análisis y para la identificación de especie si es necesaria. NOTA: para siembra en profundidad se debe utilizar sólo agar DG LECTURA Después de 5 días de incubación realice la lectura Si las placas no presentan desarrollo incube por 48 horas adicionales No cuente las colonias antes del término del período de incubación porque la manipulación de las placas pueden ocasionar un crecimiento secundario debido a la diseminación de esporas, por lo que el resultado final no sería válido Contar placas con desarrollo entre 10 y 150 colonias.

5 PRT Página 5 de Contar las colonias de mohos las que se presentan bajo una forma filamentosa característica (micelio) de color variable. Estas se desarrollan más tardíamente que las levaduras. Anotar resultados en RG Contar las colonias de levadura por separado Las colonias de levaduras se presentan en forma de colonias opacas, blancas o amarillas. Anotar resultados en RG Realizar Tinción de Gram según IT o microscopía al fresco (IT ) a las colonias sospechosas de levaduras para confirmar su presencia. Anotar el resultado en el registro código RG CALCULO Y EXPRESION DE RESULTADO Registre los resultados basados en el promedio del recuento en triplicado de la dilución seleccionada y multiplique por el correspondiente factor de dilución Aproxime el valor a dos cifras significativas. Si el tercer dígito es 6, 7, 8 o 9 adicionar una unidad al segundo dígito. Si el tercer dígito es 1, 2, 3 o 4 considerar solamente los dos primeros dígitos. Cuando el tercer dígito es 5, agregar una unidad al segundo dígito si este es impar y mantener el segundo dígito si este es par Multiplique por la correspondiente potencia de INFORME Informe los resultados en unidades formadoras de colonias (ufc)/g o ml basado en el promedio de las tres placas de la dilución del recuento Cuando las placas de todas las diluciones no tienen colonias, informe como < 1 por la menor dilución utilizada. 7.7 TÉCNICA SIEMBRA DIRECTA EN PLACA PARA ALIMENTOS QUE PUEDEN SER MANEJADOS CON PINZA. (LEGUMBRES, NUECES, ESPECIAS, CAFÉ, CACAO EN GRANO, ETC.) ANÁLISIS DE ALIMENTOS SIN DESINFECCIÓN SUPERFICIE (NSD) Antes de procesar la muestra mantenerla a -20 C por 72 horas para eliminar los ácaros e insectos que pudieran interferir Preparar placas de agar DRBC, si no se dispone de este agar o la actividad del agua de la muestra es inferior a 0,95%, use agar DG Los medios deben estar preparadas no más de 24 h antes de su uso De cada muestra transferir unos 50 g en un vaso estéril de capacidad 300 ml.

6 PRT Página 6 de Uso de etanol al 95% para flamear la pinza con la que se pondrán las subunidades de muestra en la placa Aproximadamente ubicar entre 5 a 10 subunidades o ítemes de muestra por placa de agar Flamear la pinza entre cada ítem de muestra No plaquear ítemes con mohos o deterioro visible Alinear entre 3 a 5 placas en fila e identificar con el número de la muestra, número de la placa y la fecha Incubar en oscuridad por 5 días sin invertir.si no hay desarrollo volver a incubar por 48 h adicionales Determinar la aparición de mohos en porcentaje. Si hay desarrollo de moho en los 50 ítemes o submuestras es un 100%, es en 32 es un 56% Determinar el porcentaje de ocurrencia de género y especie de moho como se indica en el punto anterior ANÁLISIS DE ALIMENTOS CON SUPERFICIE DESINFECTADA (SD) Llevar a cabo la desinfección en sumideros de laboratorio que no sean de acero inoxidable, que estén libre de residuos de cualquier ácido, con agua de grifo en funcionamiento Usar guantes y transferir unos 50 g de muestra en un vaso estéril de capacidad 300 ml Cubrir con solución de cloro comercial al 10% por 2 minutos mientras se agita el vaso en sentido de las agujas del reloj para formar un suave remolino Dejar decantar y eliminar la solución de cloro Enjuagar dos veces por un minuto el contenido con agua destilada estéril Preparar las placas de agar, sembrar ítem o subunidades de muestra como se indica en el punto Incubar por 5 días en la oscuridad, sin invertir Comparar resultados de NSD y SD de la misma muestra para determinar si la anuncia de moho se debió principalmente a una contaminación superficial o a una invasión y desarrollo a nivel interno.

7 PRT Página 7 de 7 8. REGISTROS Identificación del registro Registro control de ambiente, RG Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el análisis Laboratorio 346, RG Registro análisis de muestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos RG Almacenamiento Protección Recuperación Tiempo retención disposición Archivador verde Registros Laboratorio N 346 Sección Microbiología y Agua. Archivador verde Registros Laboratorio N 346 Sección Microbiología y Agua. Archivador azul Registros de Lecturas e informes de resultados Laboratorio Recuento aerobios mesófilos, S.aureus, Mohos y levaduras Sección Microbiología y Agua. Acceso restringido a personal Sección Microbiología. Acceso restringido a personal Sección Microbiología. Acceso restringido a personal Sección Microbiología. Papel 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos. Papel 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos. Papel 5 años y disposición en basura normal partidos en trozos. y 9. TABLA DE MODIFICACIONES Revisión Nº Pág. Modificada Motivo del cambio Fecha Aprobación 10. ANEXOS 10.1 Anexo N 1 Registro análisis de muestras de alimentos y agua Laboratorio de Recuentos RG