PROCEDIMIENTO DE METODO CUALITATIVO DE DETECCION DE SHIGELLA SPP EN MATRIZ AGUA

Transcripción

1 PRT Página 1 de 5 1. OBJETIVO Detectar en forma cualitativa la presencia de Shigella spp en muestras de aguas. 2. CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE Este procedimiento es aplicable a las muestras de agua. 3. FUNDAMENTO La shigelosis es una enfermedad gastrointestinal en humanos y causada por las especies o serogrupos del género Shigella compuesto por S. dysenteriae (grupo A), S. flexneri (grupo B), S. boydii (grupo C) y S. sonnei (grupo D). Shigella invade la mucosa intestinal, produciendo disentería caracterizada por fiebre, dolor abdominal y diarrea. La dosis infectante es baja y la mayoría de los casos la transmisión es de persona a persona. En los brotes la causa está asociada a contaminación fecal en alimentos y menos frecuente en agua. Esta infección es más común en niños y han sido reportadas en colegios, jardín infantil y guarderías. El aislamiento de Shigella es difícil por ser un microorganismo poco competitivo y porque su sobrevivencia está sujeta a la existencia de flora acompañante, a las condiciones físicas de ph y temperatura. Los métodos más utilizados son por membrana filtrante y centrifugación. 4. REFERENCIAS 4.1 Standard Methods for examination of water and wastewader, Ed. 21 th, TERMINOLOGÍA No Aplica 6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS 6.1 Equipos Incubadora a 35 C ± 1 C Vortex Refrigerador Pipetas de 1, 5 y 10 ml Placas de Petri desechables de 4,5 cm diámetro.

2 PRT Página 2 de Sistema filtración al vacío Contenedores estériles de capacidad 1 L. 6.2 Medios de cultivo e insumos Caldo Selenito F Caldo GN Adicionalmente caldo nutritivo de concentración reducida y ajustado a ph 8,0 (0,15 g caldo soya tripticasa) Alcohol al 70% Papel absorbente 7. DESARROLLO 7.1 Muestras y almacenamiento Recolectar muestras de agua en un contenedor estéril de capacidad 1 L (bolsas, WhirlPak, Ziploc, frascos Schott, etc.) Obtener muestras con tierra, sedimento, o muestras limpias Mantener entre 2 a 8 º C hasta su análisis Procesar lo más pronto posible después de su recolección. 7.2 Etapa enriquecimiento Elegir el medio de enriquecimiento selectivo para disminuir la acumulación de ácidos volátiles producto del desarrollo de bacterias potenciales antagonistas El caldo Selenito F, ha dido utilizado exitosamente para recuperar Shigella a partir de muestras de agua y arena El caldo GN ha demostrado mejor recuperación de Shigella a partir de heces Alternativamente pude usar medio nutritivo de concentración reducida ajustado a ph 8, Durante el estudio de brote, el medio selectivo puede adicionarse antibióticos utilizados en el aislamiento clínico como tetraciclina 150 µg /ml.

3 PRT Página 3 de Procedimiento Filtro Membrana Este método es conveniente para agua potable con baja turbiedad y para agua superficiales con baja concentración de bacterias del grupo coliformes Filtrar 100 ml a 1 litro a través de membrana con poro de 0,445µm y luego poner el filtro sobre la superficie de de agar XLD o MacConkey Incubar a 36º C por 24 horas Donde el crecimiento es confluente, tome una asada e inocule en caldo de enriquecimiento GN o Selenito F Incubar por 6 horas y traspasar sembrando por estría en agar MacConkey y en XLD. Para obtener colonias aisladas Elegir colonias sin color (fermentación de lactosa negativa) a partir de la membrana previamente incubada o de las placas sembradas para aislar Sembrar en TSI y LIA Incubar a 35º C por 24 horas Si las características bioquímicas son compatibles y las cepas son presumiblemente identificadas como Shigella, lisina desaminasa negativa, descarboxilasa positiva, H 2 S 7.4 Procedimiento por centrifugación Este procedimiento es aplicable a aguas superficiales, aguas residuales y sedimentos Centrifugar 200 a 250 ml de muestra de agua a 1520 x g por 15 minutos Eliminar el sobrenadante menos 2 ml finales Resuspender el botón o sedimento en 8 ml de caldo Selenito F o caldo GN Incubar la suspensión a 35º C por 24 horas Mezclar e inocular una asada a varias placas de cada uno de los medios de XLD y MacConkey Examinar las placas y elija las colonias sin color (lactosa negativa) y siembre las colonias sospechosas en agar LIA y TSI Incubar a 35º C por 24 horas.

4 PRT Página 4 de Si las características bioquímicas son compatibles y las cepas son presumiblemente identificadas como Shigella, lisina deaminasa negativa, descarboxilasa positiva, H 2 S Para muestras sólidas (sedimentos, suelos, lodos) suspenda 10 g de muestra en 100 ml de Caldo Selenito F o caldo GN y mezcle completamente Incubar la suspensión a 35ºC por 24 horas Resuspender el sedimento y siembre por estría un asada en varias placas de XLD y agar MacConkey Incubar a 35º C por 24 horas Examinar las placas y elija las colonias sin color (lactosa negativa) y siembre las colonias sospechosas en agar LIA y TSI Incubar a 35º C por 24 horas Si las características bioquímicas son compatibles y las cepas son presumiblemente identificadas como Shigella, lisina desaminasa negativa, descarboxilasa positiva, H 2 S 8. REGISTROS Registro Detección Shigella spp en muestras de alimentos y ambiente 9. ANEXOS Anexo Nº 1 Cuadro resumen reacciones en agar LIA y TSI

5 PRT Página 5 de 5 ANEXO Nº 1 Cuadro Resumen reacciones bioquímicas Organismo TSI * LIA * Shigella K/A- K/A- Salmonella K/A g+ K/A+ Escherichia A/A g- K/K- Proteus A/A g+ o K/A g+ R/A+ Citrobacter A/A g+ K/A+ Enterobacter A/A g- K/A- Aeromonas A/A - K/A- Yersinia A/A - o K/A- K/A- Plesiomonas K/A- K/A- * Reacciones de fermentación= tendido/ profundo H 2 S = + o K = alcalino A= ácido R = rojo( reacción deaminasa) g = producción de gas