Introducción al método de Membrana Filtrante para análisis bacteriológico en muestras de agua Actualización de Norma Argentina IRAM :2015

Transcripción

1 Introducción al método de Membrana Filtrante para análisis bacteriológico en muestras de agua Actualización de Norma Argentina IRAM :2015 Capacitación Mayo 2016 Dirección Técnica y Desarrollo Tecnológico Laboratorio Central Area Microbiólogia aysa

2 NORMA ARGENTINA IRAM :2015 Calidad ambiental calidad de agua Detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli Parte 1- Método de filtración por membrana para agua con bajo contenido de flora bacteriana Este método se basa en un procedimiento de filtración a través de una membrana, el posterior cultivo en un medio cromogénico y el recuento de organismos presentes en la muestra

3 NORMA ARGENTINA IRAM :2015 DOCUMENTOS NORMATIVOS IRAM Calidad del agua - Evaluación de membranas filtrantes utilizadas para análisis microbiológicos. ISO 11133:2014 Microbiología de los alimentos, piensos y agua. DOCUMENTOS BIBLIOGRAFICOS IRAM :2006 Calidad ambiental calidad de agua Detección y recuento de bacterias coliformes y de Escherichia coli Parte 1- Método de filtración por membrana para agua con bajo contenido de flora bacteriana ISO : 2014 Calidad de agua- Enumeración de Escherichia coli y bacterias coliformes. Standard Methods for the examination of water and Wastewater- 22nd edition, 2012.

4 NORMA ARGENTINA IRAM : Instituto Argentino de Normalización y certificación Centro de documentación Catálogo de normas NORMAS ARGENTINAS IRAM Búsqueda de Normas Titulo Bactérias coliformes

5 Correciones a la norma iram En punto 8.2 cambia a (21 a 24hs) Salmon cambia a rosa. Violeta cambia a azul oscuro. En tabla 1 se cambia idem 8.2 En punto 12 cambia asimilable domiciliario por según legislación vigente. En A.2.1 reactivo de Kovacs se elimina de la norma.

6 Control de calidad Microbiológicos Controles Ambientales Control de materiales Controles medios de cultivo Controles de Temperatura Envases para toma de muestra Controles de esterilización

7 Instrumental y Equipos SM Tabla 9020 B:I IRAM (normativo)

8 Medios de cultivo correctamente preparados, acondicionados, refrigerados 4 ±2º rotulados, fecha preparación, fecha de vencimiento Título de la Dirección presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Fecha / Lab. Central / Area Microbiología

9 Preparación y Fraccionamiento (autoclave de medios de cultivo hasta 9 litros) Título de la Dirección presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Fecha / Lab. Central / Area Microbiología

10 Medios de cultivo y su preparación Respetar y cumplir con las recomendaciones especificadas en el rotulo del envase por el fabricante. ph, esterilización, conservación, vencimiento, etc AGAR ENDO LES (99 C, 1, no autoclavar, plaqueado conservar máximo hasta 15 días a 4 ±2ºC). AGAR NUTRITIVO (MUG) (121 C, 15 minutos ). ACC (AGAR CROMOGENICO COLIFORMES(99 C,1 no autoclavar y agregar el suplemento selectivo cuando la temperatura descienda a los 50 C, plaqueado conservar hasta 1 mes a 4 ±2ºC ). Suplemento selectivo E.Coli/Coliformes Vancomicina 5 mg/l(inhibe el crecimiento de bacterias Grampositivas) Cefsulodina 5 mg/l (suprime el crecimiento de Pseudomonas spp y Aeromonas spp Título de la Dirección presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Fecha / Lab. Central / Area Microbiología

11 Componentes de ACC Promotores de crecimiento( aún células injuriadas) Peptonas Piruvato Sorbitol Buffer fosfatos Inhibidores(Gram+ y gram no coliformes) Tergitol 7 Sustratos cromogénicos Salmon Gal X-Glucuronido

12 CHROMOCULT COLIFORM AGAR (E.coli /Coliformes suplemento selectivo Sustrato + Enzimas Producto Sustrato Cromogénico Sustrato Cromogénico Color Salmon- GAL X-Glucuronide Coliformes totales β-d-galactosidasa + - Rosa- Roja Escherichia coli β-d-glucuronidasa + + Azul

13 Autoclave realizar control biológico de esterilización (Esporas de Bacilo Stearothermophilus)

14 Sondas registradoras monitoreo del ciclo completo de esterilización

15 Informe control esterilización Cuanto tiempo deben permanecer los caldos con Carbohidratos?(SM 9020 B 4)

16 Registradores de ciclo de esterilización

17 Material acondicionado para su esterilización cintas indicadoras, papel no tóxico Rampa de filtración acero Inoxidable

18 FILTROS PLASTICOS autoclavables Título de la Dirección presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Fecha / Lab. Central / Area Microbiología

19 Equipo de filtración acero inoxidable Título de la Dirección presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Fecha / Lab. Central / Area Microbiología

20 EQUIPOS DE FILTRACIÓN CON SENSORES TÁCTILES Título de la Dirección presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Fecha / Lab. Central / Area Microbiología

21 CONTROLES DE CALIDAD EN SIEMBRA: Sistema de filtración: cada 6/12 filtrar 100 ml de agua desionizada estéril y sembrar en el agar en estudio(alfa,beta,gama). La frecuencia de estos controles las establece el propio laboratorio. Aplicando este tratamiento se realizan blancos de método para control de esterilidad de las placas de petri, medios de cultivo y membranas al mismo tiempo. Control Ambiental : control en superficie para mesadas control en aire del ambiente de trabajo control de envases para la toma de muestra Título de la Dirección presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Fecha / Lab. Central / Area Microbiología

22 controles ambientales del ensayo

23 Buffer de Lavado Standard Methods 9050 C se utiliza para el lavado de filtros Sn stock de Buffer fosfato: (disolver 34,0 g de fosfato monobásico de potasio en 500 ml de agua desionizada).ajustar el ph a 7,2 ±0,5 con soluciones de HCl 1N o NaH0 1N utilizando phmetro y llevar a 1000 ml con agua desionizada Sn de Cloruro de magnesio: (disolver 81,1 g de cloruro de magnesio-hexahidrato en 1 litro de agua desionizada). Solución Buffer de Lavado: medir con pipeta 1,25 ml de solución buffer fosfato y 5 ml de solución de Cloruro de magnesio y llevar a un volumen de 1000 ml con agua desionizada. Fraccionar en pisetas autoclavables de 1000 ml. Esterilizar por autoclave a 121 º C durante 15 minutos. Mantener en cámara fría a una temperatura de 4 ± 2ºC por un período no mayor a 15 días.

24 ENSAYO Etapa 1: Filtración Etapa 2: Incubación Etapa 3: Lectura (recuento) Confirmación Confirmación Colonias Coliformes Totales (ENDO) Confirmación Colonias Escherichia Coli Pasaje NA-MUG (ENDO) Test de oxidasa(acc) Etapa 4 : Informe de ensayo

25 Método filtración por membrana Se hace pasar un volumen determinado de muestra a través de una membrana filtrante de un poro tal que retenga los microorganismos en estudio ; la membrana luego se transfiere con una pinza colocando el frente de la misma hacia arriba sobre la superficie de un medio sólido, evitando la formación de burbujas entre ambas.(para ciertos microorganismos la membrana se coloca en forma invertida) Se requiere de un equipo de filtración y una bomba de vacio para acelerar el proceso.

26 Esquema tipo de filtración Muestra Embudo Membrana bomba de vacio placa petri medio sólido colector marriot Título de Dirección la presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Lab. FechaCentral / Area Microbiología

27 Aplicación: Adecuada para muestras de agua que contengan bajo contenido de materias en suspensión por ejemplo: Agua potabilizada de toma superficial Agua potabilizada de toma subterránea Agua cruda de toma subterránea Agua en sistema de distribución Rango de la determinación :<1 a >100 ufc/100ml.

28 Microorganismos : Grupo Coliformes totales Genero klebsiella spp Kp Genero Escherichia spp Ec Genero Enterobacter spp Ea Genero citrobacter spp Enterococcus faecalis Ef Pseudomonas aeruginosa Ps

29 Abreviaturas y definiciones ANEXO B (informativo) UFC: unidad formadora de colonias.(considerando que cada colonia fue generada por un microorganismo). ATCC: American type coulter colleccion. Coliformes Totales: microorganismos perteneciente a la familia Enterobacteriaceae que expresan la enzíma β -galactosidasa.bacílos Gram negativos (G-), anaerobios facultativos, no esporulados,citocromo oxidasa negativos, capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas. En el medio de agar M-Endo-Les, fermentan la lactosa produciendo aldehídos y ácidos que junto con la fucsina,recubren la superficie de las colonias con un característico brillo metálico en un tiempo no mayor a 24 hs a 35(±0,5)ºC. Escherichia coli :microorganismo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae que expresa las enzimas β galactosidasa y β- glucuronidasa.capaz de escindir el sustrato MUG, formando 4- metilumbeliferona, que se caracteriza por ser fluorescente a la luz ultravioleta. Pertenece al grupo de coliformes fecales. MUG: 4-metilumbeliferil-β-D-glucurónido.

30 Etapa Nº1 Siembra Flujo Laminar

31 Siembra BHV 36ºC /Agar Endo Les Agar Cetrimide

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36 Etapa Nº 2 INCUBACIÓN Coliformes Totales, E. coli Agar Endo Les Incubar 22 a 24 hs a 35+/- 0.5ºC Agar Coliformes Incubar 21+/- 3 hs a 36ºC +/- 2ºC

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38 CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO ISO 11133:2014 Contar con un cepario para evaluar todos los medios de cultivo producidos Realizar controles con organismos target y organismos no target IPR (Agar evaluado/agar referencia) 70% Selectividad. Inhibición total del crecimiento de una cepa de referencia no target en el medio de cultivo selectivo, bajo condiciones definidas. Especificidad. Demostración de las características visuales específicas de los microorganismos target pero no de los no target, bajo condiciones definidas.

39 Control calidad Agar ENDO LES/COLIFORMES/BRILLANCE Escherichia coli ATCC 25922

40 Control calidad Agar ENDO LES/ COLIFORMES/ BRILLANCE klebsiella pneumoniae ATCC 13883

41 Aseguramiento de la calidad IRAM :2015 Título de la Dirección presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Fecha / Lab. Central / Area Microbiología

42 Control calidad Agar coliformes I Productividad IRAM :2015

43 Enterobacter aerogenes Escherichia coli ATCC ATCC rosa azul Título de la Dirección presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Fecha / Lab. Central / Area Microbiología

44 Control calidad Agar coliformes IRAM :2015 Especificidad - Selectividad

45 MIX CONTROL 3 CEPAS(Ec-Kp-Sal) AGAR M-ENDO LES CHROMOCULT COLIFORM AGAR

46 Etapa Nº3 Lectura y confirmación Realizar lectura de las placas una por una diferenciando el o los tipos de colonias presentes en la membrana. Diagnostico presuntivo: AGAR ENDO LES Coliformes: Colonias típicas con brillo metálico. Colonias atípicas(rojas oscuras) No Coliformes ( transparentes, rosa claro) Diagnóstico definitivo : confirmar las colonias de coliformes en caldo LST 48 hs y caldo VB 48 hs (del LST) n 5 picar 5 n 6 a 25 picar 5 n >25 siguiente formula n (redondear al entero superior) Ejemplo: 32 ufc 32= 5, 6 picar 6 colonias. Ejemplo: 61 ufc 61= 7,. 8 picar 8 colonias.

47 Confirmación Repicar las colonias presuntivas de coliformes totales (Agar Endo LES) Caldo LST incubar por 24 a 48hs a 35± 0,5 C. Repicar los tubos LST positivos a caldo VB, incubar por 24 a 48 hs a 35± 0,5 C. Traspasar membrana al Agar Nutritivo + MUG incubar por 4 hs a 35 ± 0,5 ºC leer bajo lampara UV Realizar test de oxidasa del PCA ansa de plástica o platino. (Agar Cromogénicos; Agar Endo LES) Realizar api test (opcional).

48 Confirmación Agar ENDO Repicar las colonias presuntivas de coliformes totales 1)Test de oxidasa Agar CROMOGENICO 1)Test oxidasa 2) Caldo LST 24 a 48hs a 35± 0,5 C. Repicar los tubos LST positivos 3) Caldo VB 24 a 48 hs a 35± 0,5 C. 4)Traspasar membrana al Agar Nutritivo + MUG 4 hs a 35 ± 0,5 ºC leer bajo lampara UV Título de la Dirección presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / Fecha / Lab. Central / Area Microbiología

49 Lectura Agar Endo LES presuntivo

50 Lectura Agar Endo LES Agua cruda subterránea presuntivo Capacitación RELAS mayo 2016

51 Repique a Caldo Lauryl sulfato triptosa

52 MUESTRAS CLIENTE EXTERNO AGAR M-ENDO LES CHROMOCULT COLIFORM AGAR

53 Lectura Agar Coliformes Agua cruda subterránea

54 MUESTRA CLIENTE EXTERNO Medio ACC

55 Lectura Agar Coliformes Agua cruda subterránea

56 MUESTRAS CLIENTE EXTERNO Medio ACC

57 Lectura Agar Coliformes muestras particulares

58 Confirmación Test oxidasa

59 Método de partición (SM-9222-G) Traspasar la membrana a un agar nutritivo conteniendo sustrato MUG (4-metil-umbeliferyl-ß- D-Glucurónido). Incubar por 4 hs. observar bajo lampara de luz UV. la presencia de halo azul fluorescente. (E. coli). (se puede recomfirmar en caldo EC/triptofano,44,5 ± 0,2 C,24 hs incubación,reactivo kovacs).

60 Escherichia coli ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC Medio NA-MUG

61 VENTAJAS Y DESVENTAJAS M. CROMOGÉNICOS MEDIO ENDO LES PROTECCIÓN AL PERSONAL PROTECCIÓN MEDIO AMBIENTE COLONIAS COLIFORMES TOTALES 21 +/-3 hs + 24HS 24 hs+96 hs COLONIAS E.COLI 21+/-3hs 48 hs BENEFICIOS/COSTOS

62 control de Agar cetrimida cepa ATCC Pseudomonas aeruginosa

63 Enterococcus faecalis ATCC en medio Agar de Slanetz-Bartley.

64 Calidad de agua para ensayos microbiológicos (SM tabla 9020:II) (Anexo D informativo)

65 EQUIPO SELLADOR TERMICO MPN (Colilert)

66 ß-D galactosidasa hidroliza el sustrato cromogénico ONPG (orto-nitrofenil-b-d-galactopiranósido) Título de Dirección la presentación técnica / Dirección y Desarrollo Gerencia Tecnológico o Sector / / Fecha Lab. Central / Area Microbiología

67 ß-D-glucuronidasa hidroliza sustrato fluorogénico MUG (4-metil-umbeliferil-B-D-glucurónido) bajo acción luz UV

68 Incubación y lectura colilert ventaja y desventaja Rápido diagnostico 20 a 24 hs. Se puede detectar presencia/ausencia (sin el uso de la bandeja cuadriculada ni el sellador térmico) Costo muy elevado.

69 Colilert falsos positivos Coliformes totales :Bacterias no coliformes como Aeromonas y/o Pseudomonas pueden producir pequeñas cantidades de B-D-galactosidasa pero son suprimidas E.coli Algunas cepas de Shigella sp poseen enzima B-D-glucuronidasa (pero por tratarse de un patogeno humano, fuera del huesped permanece poco en medio ambiente).

70 Ventajas MF Técnica ampliamente reproducible, puede ser utilizada para estudios con gran cantidad de muestras. Mayor Volúmen de filtrado. Produce resultados numéricos mas rápido que el procedimiento de MPN. Extremadamente útil para monitoreo de aguas de red de distribución y otras variedades de aguas naturales. Requiere poco espacio para muchas muestras. Facilita el alerta Temprano de riesgo sanitario por su menor tiempo incubación. Cuando la técnica de MF no ha sido utilizada previamente en un laboratorio, se recomienda trabajar en paralelo con el método utilizado hasta el momento,para demostrar su aplicabilidad y comparabilidad.(9222 A. introducción SM) Se puede aplicar aguas salinas.

71 Desventajas MF Limitaciones: No para aguas con alta turbiedad o con alto contenido de bacterias no coliformes (efecto Background ) No recomendable para aguas servidas No aguas cloacales con tratamiento primario ( pueden contener sustancias tóxicas tales como metales pesados y/o compuestos orgánicos tales como fenoles).

72 Ventajas y desventajas NMP Adecuado método para muestras con alta carga bacteriana Útil para muestras con alta turbiedad Moderado a bajo costo? Mayor espacio para moderado numero de muestras No es tan fácilmente reproducible como MF No siempre se procesa un volumen representativo de la muestra Mayor tiempo de incubación Demora mucho mas tiempo en dar aviso el alerta por riesgo sanitario Mayor volumen de Material utilizado previo al ensayo (acondicionamiento vidrio) y posterior (descontaminación)

73 Desventaja NMP espacio tiempo material

74 Desventaja (tiempo incubación)

75 LOGRAR DISMINUIR TIEMPO DE DIAGNOSTICO DEFINITIVO

76 Muchas gracias