enero de 2008 Validación del método Colilert -18/Quanti-Tray para el recuento de E. coli y de bacterias coliformes en muestras de agua

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1 Validación del método Colilert -/Quanti-Tray para el recuento de E. coli y de bacterias coliformes en muestras de agua enero de 2 One IDEXX Drive Westbrook, Maine 42 EE. UU. idexx.com 2 IDEXX Laboratories, Inc. All rights reserved All /TM marks are owned by IDEXX Laboratories, Inc. or its affiliates in the United States and/or other countries.

2 Validación del método Colilert -/Quanti-Tray para el recuento de E. coli y de bacterias coliformes en muestras de agua 1 Introducción El método Colilert -/Quanti-Tray es una prueba diseñada específicamente para el recuento NMP (Número Más Probable) de E. coli y bacterias coliformes a partir de muestras de agua potable u otras aguas de características similares, ya sea tratada o sin tratar. Colilert- detecta de manera simultánea el número de coliformes totales y E. coli en el agua. Se basa en la Tecnología de Sustrato Definido (Defined Substrate Technology, DST). El reactivo DST se mezcla con 1 ml de muestra y se incuba como prueba de presencia/ausencia (PA) o prueba para determinar el número más probable (NMP). Cuando las bacterias coliformes metabolizan el nutriente indicador ONPG, el color de la muestra se vuelve amarillo. Cuando E. coli metaboliza un segundo nutriente indicador (MUG), la muestra emite fluorescencia con luz UV. El método Colilert- permite la detección simultánea de estas bacterias en horas, a una concentración de 1 ufc/1 ml y en presencia de números tan elevados de bacterias heterótrofas como 2 x 1 6 /1 ml de muestra. El método Quanti-Tray está diseñado para obtener recuentos bacterianos cuantitativos a partir de muestras de 1 ml utilizando los reactivos DST. La mezcla de reactivo/muestra se añade a la bolsa Quanti-Tray y, antes de la incubación, se sella utilizando el dispositivo de sellado para Quanti-Tray. La bolsa está diseñada para que, tras el sellado, 51 pocillos contengan la mezcla de reactivo/muestra. El dispositivo de sellado es un instrumento que consta de unos rodillos calientes, accionados por motor, que se ha diseñado para el sellado de las bolsas Quanti-Tray. Se cuenta el número de pocillos positivos y, a partir de la tabla correspondiente, se determina el NMP de bacterias coliformes y/o E. coli. 2 Alcance de la aplicación del método Colilert -/Quanti-Tray El método Colilert -/Quanti-Tray está diseñado principalmente para el análisis de agua potable y otros tipos de agua de características similares. Cuenta con un gran número de autorizaciones en Norteamérica (EE.UU, Canadá y Méjico), Sudamérica (Brasil, Argentina, Chile y Colombia), Europa (Dinamarca, Alemania, Hungría, Islandia, Irlanda, Italia, Noruega, España y Reino Unido) y Extremo Oriente (Japón y Corea). Además, cuenta con la autorización para el análisis de aguas embotelladas (Asociación Internacional de Agua Embotellada) y para el análisis de agua purificada para uso farmacéutico (Farmacopea de los EE.UU). En los EE.UU. también recibió la autorización por parte de la EPA (Agencia de protección medioambiental) para el análisis de bacterias coliformes y E. coli en aguas de manantial y aguas freáticas, y para el recuento de E. coli en aguas ambientales, de uso recreativo y residuales. 3 Identificación de microorganismos diana (ISO/TR 43 apartado y.2) En el método Colilert -/Quanti-Tray, las bacterias coliformes son aquellas que producen un color amarillo por acción de la β-galactosidasa sobre el orto-nitrofenil-β- D-galactopiranósido (ONPG), y E. coli son aquellas bacterias coliformes que, 1

3 además, emiten una fluorescencia azul con luz UV por la acción de la β- glucuronidasa sobre el 4-metil-umbeliferil-β-D-glucurónido (MUG). 3.1 Modelo de exposición basado en un cultivo puro (ISO/TR 43 apartado 1.2.1) Las definiciones de las reacciones por bacterias diana y no diana se confirmaron mediante la exposición del sistema Colilert-/Quanti-Tray a cultivos puros de cepas de referencia de E. coli, bacterias coliformes y bacterias Gram-negativas no coliformes obtenidas a partir de las colecciones de la ATCC. Las reacciones típicas de estas cepas de referencia aparecen recogidas en la tabla 1. IDEXX utiliza estas cepas para realizar los análisis de control de calidad rutinarios del método Colilert- /Quanti-Tray. Tabla 1 Cepas de referencia de E. coli, bacterias coliformes y bacterias Gram-negativas no diana, utilizadas para confirmar las reacciones positivas y negativas típicas del método Colilert -/Quanti-Tray Bacteria Nº ATCC* Reacción método Colilert- Escherichia coli 2522 Color amarillo intenso Fluorescencia azul intenso con luz UV Citrobacter freundii Color amarillo intenso No emite fluorescencia con luz UV Klebsiella pneumoniae 3 Color amarillo intenso No emite fluorescencia con luz UV Enterobacter aerogenes 4 Color amarillo intenso No emite fluorescencia con luz UV Pseudomonas aeruginosa 15 No hay crecimiento No hay color amarillo No emite fluorescencia con luz UV Aeromonas hydrophila No hay crecimiento No hay color amarillo No emite fluorescencia con luz UV * Colección Americana de Cultivos Tipo 3.2 Estudios de sensibilidad, especificidad y selectividad (ISO/TR 43 apartado.2) En lo que respecta a los métodos microbiológicos, el informe técnico ISO/TR 43 define estas características de la siguiente forma: Sensibilidad - la fracción del total de positivos que se asigna correctamente en el recuento obtenido; Especificidad - la fracción del total de negativos que se asigna correctamente en el recuento obtenido; Selectividad - el cociente ente el número de colonias diana y el número total de colonias en el volumen de muestra. En el caso del método Colilert-/Quanti-Tray, estas características están relacionadas con el número de pocillos positivos para coliformes o E. coli que, efectivamente, contienen la bacteria diana, y con el número de pocillos negativos que realmente son negativos para la bacteria diana. La valoración de la sensibilidad, 2

4 la especificidad y la selectividad del método Colilert-/Quanti-Tray se logró identificando los aislamientos β-galactosidasa y β-glucuronidasa positivos de los pocillos positivos obtenidos a partir de muestras naturales en las que se añadieron cantidades conocidas de agua de río a muestras de agua potable sin cloro. Se obtuvo 1 litro de muestra de agua potable sin cloro al que se añadieron cantidades conocidas de tres fuentes de aguas superficiales (dos ríos y un embalse). Tras la incubación, se seleccionaron 1 pocillos de color amarillo, pero que no emitían fluorescencia, de las 3 muestras (3-5 pocillos por cada muestra). La selección se llevó a cabo de forma que se garantizara la inclusión de toda la gama de intensidades posibles para el color amarillo. Asimismo, se seleccionaron 1 pocillos de color amarillo, y que emitían fluorescencia, para abarcar toda la gama de intensidades posibles para la fluorescencia. De las 3 muestras, sólo se dispuso de 54 pocillos negativos, de los cuales dos mostraron un crecimiento turbio. Las reacciones β-galactosidasa y β-glucuronidasa positivas y/o negativas se verificaron y los aislamientos se identificaron utilizando paneles miniaturizados para la identificación de tipo BBL Crystal TM E/NF (Entéricos/ No Fermentadores, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, EE.UU.) Cálculo de la sensibilidad, especificidad, selectividad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos Para cada parámetro los datos de identificación se dividieron en cuatro categorías: a = número de pocillos positivos que contenían coliformes o E. coli (verdaderos positivos); b = número de pocillos negativos que contenían coliformes o E. coli (falsos negativos); c = número de pocillos positivos que no contenían coliformes, ni E. coli (falsos positivos); d = número de pocillos negativos que mostraban crecimiento y que no contenían ni coliformes, ni E. coli (verdaderos negativos). A partir de los datos obtenidos, la sensibilidad, especificidad, selectividad, tasa de falsos positivos y tasa de falsos negativos para coliformes y E. coli se calcularon de la siguiente forma: Sensibilidad = a / (a+b) Especificidad = d / (c+d) Selectividad = log 1 [(a+c) / (a+b+c+d)] Tasa de falsos positivos = c / (a+c) Tasa de falsos negativos = b / (b+d) Además se calculó un parámetro adicional, la eficiencia (E; fracción de pocillos que se asignan correctamente), mediante la fórmula E = (a+d) / (a+b+c+d) Coliformes distintos a E. coli De los 1 pocillos amarillos sin fluorescencia con los que se realizaron subcultivos, se obtuvieron aislamientos β-galactosidasa. En estas placas no se observaron reacciones β-glucuronidasa. En el Apéndice A1 se muestran las reacciones oxidasa e indol, los perfiles BBL Crystal TM E/NF y las identificaciones de estos aislamientos. Todos se identificaron como miembros de la familia Enterobacteriaceae distintos a E. 3

5 coli, β-galactosidasa positivos y β-glucuronidasa negativos. En total, se recuperaron 23 especies de coliformes (Tabla 2) E. coli De los 1 pocillos amarillos con fluorescencia con los que se realizaron subcultivos, se obtuvieron aislamientos β-glucuronidasa. En el Apéndice A2 se muestran las reacciones oxidasa e indol, los perfiles BBL Crystal TM E/NF y las identificaciones de estos aislamientos. Se identificaron aislamientos como E. coli. El último se identificó como Klebsiella oxytoca. Este aislamiento presentó una reacción β- glucuronidasa positiva en el panel Crystal TM E/NF Pocillos negativos Se realizaron subcultivos con 54 pocillos negativos, de los cuales únicamente dos habían presentado crecimiento. Estos dos pocillos presentaron colonias β- galactosidasa y β-glucuronidasa negativas, que resultaron ser oxidasa positivas e indol negativas (Apéndice A3). Ambas colonias se identificaron como Shewanella putrefaciens en el sistema BBL Crystal TM E/NF. No se obtuvo crecimiento en los 52 pocillos restantes. Tabla 2 Identificación de bacterias coliformes (número de aislamientos) recuperadas a partir de pocillos positivos Colilert -/Quanti-Tray para coliformes distintos a E. coli Cedecea lapegei (1) Kluyvera ascorbata () Citrobacter amalonaticus (2) Kluyvera cryocrescens (3) Citrobacter freundii (1) Leclercia adecarboxylata (1) Enterobacter aerogenes (1) Pantoea agglomerans () Enterobacter asburiae (1) Serratia fonticola (1) Enterobacter cancerogenus (1) Serratia liquefaciens (3) Enterobacter cloacae (25) Serratia marcescens (1) Enterobacter sakazakii (7) Serratia odorifera (1) Escherichia vulneris (4) Serratia plymuthica (4) Hafnia alvei (1) Serratia rubidea (1) Klebsiella oxytoca (4) Serratia spp (1) Klebsiella pneumoniae (6) 3.3 Determinación de las características relacionadas con la sensibilidad y la especificidad Bacterias coliformes En el contexto de la prueba Colilert-/Quanti-Tray, los coliformes son microorganismos que dan lugar a un color amarillo, emitiendo o no fluorescencia. Los resultados para los parámetros calculados son los siguientes: Sensibilidad = a / (a+b) = 2 / (2+) = 1 Especificidad = d / (c+d) = 2 / (+2) = 1 Selectividad = log 1 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log 1 [(2+) / (2+++2)] = -,4 Tasa de falsos positivos = c / (a+c) = / (2+) = Tasa de falsos negativos = b / (b+d) = / (+2) = Eficiencia (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (2+2) / (2+++2) = 1 4

6 3.2.3 E. coli En el contexto de la prueba Colilert-/Quanti-Tray, E. coli son microorganismos que dan lugar a un color amarillo y emiten fluorescencia. Los resultados para los parámetros calculados son los siguientes: Sensibilidad = a / (a+b) = / (+) = 1 Especificidad = d / (c+d) = / (1+) =, Selectividad = log 1 [(a+c) / (a+b+c+d)] = log 1 [(+1) / (++1+)] = -,35 Tasa de falsos positivos = c / (a+c) = 1 / (+1) =,1 Tasa de falsos negativos = b / (b+d) = / (+) = Eficiencia (E) = (a+d) / (a+b+c+d) = (+) / (++1+) =,5 Los resultados del análisis de los datos demuestran que, para las bacterias coniformes, el método Colilert-/Quanti-Tray tiene una sensibilidad y especificidad elevadas y una tasa de falsos positivos y falsos negativos igual a cero. El método es también muy selectivo, con un valor de -,4, superior al valor de referencia -1 que sugiere el informe técnico ISO/TR 43 para los métodos de recuento de colonias. Se puede decir que el método es muy eficiente para bacterias coliformes, con un valor de eficiencia de 1. Los datos de identificación demuestran que el método Colilert - /Quanti-Tray recupera una amplia gama de bacterias coliformes. El método Colilert-/Quanti-Tray también es muy sensible y específico para E. coli. La selectividad (-,35) es inferior a la obtenida para las bacterias coliformes. Este es un resultado que cabe esperar en un sistema de análisis dual en el que E. coli es un subgrupo dentro de las bacterias coliformes. Aún así, el valor sigue siendo mejor que el valor de referencia del informe técnico ISO/TR 43. El método sigue siendo muy eficiente (E =,5) para la detección de E. coli. 4 Incertidumbre del recuento (ISO 43 apartado y Apéndice B) La repetibilidad y la reproducibilidad son dos estimaciones de la fiabilidad que se puede alcanzar con un método analítico. Pueden ser valoraciones respecto al método en su conjunto utilizando muestras naturales adecuadas, o respecto a la incertidumbre del recuento asociada con la lectura de resultados de un método en concreto. El resultado obtenido con cualquier método dependerá de la facilidad con la que los analistas puedan realizar un recuento de colonias o considerar una reacción NMP como positiva, lo que dependerá de lo distinta que sea la morfología de las colonias de los microorganismos diana o no diana a la hora de hacer un recuento en agar, o de la nitidez de las reacciones positivas o negativas de las pruebas NMP realizadas en caldo de cultivo. Por lo tanto, las valoraciones de la incertidumbre del recuento son una indicación de los posibles problemas que podrían darse al adoptar un método de manera generalizada. La repetibilidad (r) y la reproducibilidad (R) se definen de la siguiente forma: Repetibilidad concordancia entre los resultados de mediciones sucesivas de la misma medida, llevadas a cabo en las mismas condiciones de medición. Reproducibilidad concordancia entre los resultados de mediciones de la misma medida, llevadas a cabo en distintas condiciones de medición. 5

7 Cuando esto se aplica a los recuentos de colonias microbiológicas en placas de agar o reacciones positivas en una prueba NMP, esas mismas o distintas condiciones se refieren al analista que hace el recuento. Por lo tanto, en este contexto, la repetibilidad es la concordancia entre los recuentos obtenidos por un mismo analista tras repetir los recuentos y la reproducibilidad es la concordancia entre los recuentos obtenidos por dos o más analistas tras repetir los recuentos. Normalmente, la valoración de la reproducibilidad brinda más información que la valoración de la repetibilidad. El Apéndice B del informe técnico ISO/TR 43 proporciona unas directrices sobre la valoración de la repetibilidad y la reproducibilidad del recuento utilizando desviaciones estándar relativas (DER) de los recuentos repetidos. Además, recomienda que, en el caso de cultivos puros, las DER deberían ser <,2 (es decir, una desviación máxima del 2 %). Los analistas de IDEXX llevaron a cabo estudios sobre la incertidumbre de los recuentos. Los datos están incluidos en el Apéndice B. El recuento se realizó de manera que cada analista desconociera los recuentos realizados por otros analistas, y los NMP resultantes se registraron como números enteros. Las DER calculadas para los NMP del sistema Colilert-/Quanti-Tray inoculado con un coliforme típico (Klebsiella pneumoniae ATCC 336) y E. coli (ATCC 2522) fueron: Klebsiella pneumoniae Repetibilidad =,22 Reproducibilidad =,2 Escherichia coli Repetibilidad =, Reproducibilidad =,7 Los valores para el coliforme típico son del orden del valor de referencia <,2 (ISO/TR 43 apartado B1), mientras que los valores para E. coli están muy por debajo del valor de referencia, indicando que con el método Colilert-/Quanti-Tray puede lograrse un recuento del NMP fiable para Klebsiella pneumoniae y para E. coli. 5 Robustez sensibilidad a lo largo del tiempo (ISO/TR 43 apartado y B.4) Dos aspectos de la robustez son importantes para el método Colilert -/Quanti- Tray : el periodo de incubación recomendado de -22 horas y el periodo de validez de hasta 15 meses cuando Colilert- se almacena entre 4 y 25 ºC. En el Apéndice C se incluyen los recuentos realizados por duplicado de suspensiones con un número bajo de cultivos de referencia de E. coli, Klebsiella pneumoniae y Citrobacter freundii tras horas y 22 horas de incubación para el mismo lote de Colilert-, almacenado durante 541 días a 25 C. 5.1 Robustez del tiempo de incubación Se obtuvieron 4 resultados emparejados para realizar los recuentos tras horas y 22 horas de la incubación. Para E. coli los 4 recuentos emparejados fueron los mismos tras los dos tiempos de incubación. Pero, para Klebsiella pneumoniae 47 de los recuentos ( %) resultaron iguales, mientras que el último recuento emparejado mostró un incremento de un único pocillo positivo a las 22 horas de incubación. Sin embargo, para Citrobacter freundii hubo un incremento en los recuentos en de las muestras (27%) tras las 22 horas de incubación, en comparación con las horas de incubación. Todos estos recuentos más elevados, excepto uno, fueron incrementos en un único pocillo positivo o dos. Esta cepa de Citrobacter parece 6

8 mostrar una tasa de crecimiento relativamente más lenta o una cinética enzimática más débil, en comparación con las otras bacterias analizadas. Los datos demuestran que para E. coli y para bacterias coliformes robustas, como Klebsiella pneumoniae, el periodo de incubación recomendado de -22 horas es robusto. Pero en el caso de algunas bacterias con crecimiento más lento, o productoras de enzimas débiles, puede haber un aumento en los recuentos a las 22 horas de incubación, en comparación con los recuentos obtenidos a las horas de incubación. El fenómeno de los incrementos en los recuentos a lo largo de un periodo de incubación recomendado (por ejemplo, de -24 horas para los métodos típicos de filtración con membranas de la norma ISO 3-1) es muy conocido, especialmente en el caso de coliformes ambientales. Sin embargo, siempre que los incrementos en los recuentos tras una incubación más larga no sean excesivos, los recuentos obtenidos a las horas de incubación, con fines prácticos y operativos, se consideran aceptables. 5.3 Robustez del almacenamiento del medio Colilert- El medio Colilert- tiene un periodo de validez de meses cuando se almacena entre 4 y 25 C. Los datos de las tres bacterias analizadas con el mismo lote de medio, conservado a 25 ºC y tras 541 días de almacenamiento (muy por encima del periodo de un año establecido), no muestran ninguna diferencia en el rendimiento. Se eligió la temperatura de almacenamiento superior ya que, en comparación con un almacenamiento a temperaturas de refrigeración, representa un mayor reto a la estabilidad del medio Colilert-. 6 Límite superior de trabajo (ISO/TR 43 apartado y 6.3.3) La prueba Colilert -/Quanti-Tray es un método de NMP con un rango de recuento arbitrario entre y 21, determinado por el número de pocillos de la bolsa Quanti- Tray. Según el apartado del informe técnico ISO/TR 43, no puede establecerse un límite superior para los métodos de NMP por razones prácticas y estadísticas, ya que la precisión no depende de forma sencilla del número de partículas introducido en la unidad de detección". 7 Precisión (ISO/TR 43 apartado y.5.5) La precisión de un método de NMP se describe mediante los intervalos de confianza del 5% calculados para cada uno de los valores de NMP (ISO/TR 43 apartado.5.5). En el Apéndice D se incluyen los intervalos de confianza para los recuentos obtenidos con el método Colilert -/Quanti-Tray, calculados a partir del programa del Manual online para el Análisis Bacteriológico (Bacteriological Analytical Manual, BAM; de la FDA (Food and Drug Administration) de los EE.UU. Para cada NMP puede obtenerse una repetibilidad teórica, basándose en el valor de NMP y sus intervalos de confianza. En el Apéndice D también se incluyen los valores de incertidumbre relativa para cada NMP (log 1 DE, calculados a partir de los intervalos de confianza del 5% del NMP) y de repetibilidad (incertidumbre estándar relativa) expresados como coeficientes de variación (CV%). Estos valores de Poisson pueden utilizarse como valores de precisión mínima con los que cualquier dato apropiado que pueda tener un laboratorio (por ejemplo, sobre la variación a la hora de decantar el volumen de análisis o la incertidumbre de un recuento) puede combinarse para obtener una estimación global de la repetibilidad para cada NMP. 7

9 Bibliografía.1 Normas ISO ISO 3-1:2 Water Quality Detection and enumeration of Escherichia coli and coliform bacteria Part 1: Membrane filtration method. Ginebra: Organización Internacional para la Estandarización. ISO/TR 43:2(E) Water Quality Guidance on validation of microbiological methods. Ginebra: Organización Internacional para la Estandarización.

10 Apéndice A: Datos de los estudios de sensibilidad, especificidad y selectividad (véase el apartado 3.2) Apéndice A1 Identificación de aislamientos de pocillos amarillos sin fluorescencia del método Colilert -/Quanti-Tray Ref. aislamiento Oxidasa Indol Perfil Crystal E/NF Identificación Confianza Y Enterobacter sakazakii,561 Y Pantoea agglomerans,72 Y Kluyvera cryocrescens,2 Y Enterobacter cloacae,62 Y Kluyvera cryocrescens,627 Y Pantoea agglomerans,77 Y Klebsiella oxytoca,25 Y Pantoea agglomerans,41 Y Kluyvera ascorbata,264 Y Enterobacter cloacae,6 Y Citrobacter freundii,335 Y Enterobacter cloacae,26 Y Enterobacter sakazakii,6 Y Kluyvera ascorbata,25 Y Kluyvera ascorbata,72 Y Escherichia vulneris,5764 Y Pantoea agglomerans,32 Y Klebsiella oxytoca,524 Y Serratia liquefaciens,57 Y Enterobacter cloacae,43 Y Cedecea lapagei,35 Y Pantoea agglomerans,76 Y Enterobacter sakazakii,734 Y Leclercia adecarboxylata, Y Klebsiella pneumoniae,154 Y Pantoea agglomerans,776 Y Serratia rubidaea,42 Y Enterobacter asburiae,54 Y Serratia liquefaciens,5545 Y Kluyvera ascorbata,2 Y Klebsiella oxytoca,555 Y Enterobacter cloacae,7 Y Enterobacter cloacae,61 Y Citrobacter freundii, Y Citrobacter freundii,4 Y Pantoea agglomerans,76 Y Citrobacter freundii,73 Y Klebsiella pneumoniae,241 Y Klebsiella pneumoniae,4 Y Escherichia vulneris,475 Y Enterobacter cloacae,43 Y Enterobacter cloacae,673

11 Y Kluyvera ascorbata,25 Y Enterobacter sakazakii,1 Y Enterobacter sakazakii,4 Y Kluyvera ascorbata,43 Y Klebsiella pneumoniae,53 Y Enterobacter sakazakii,4 Y Enterobacter cloacae, Y Enterobacter cancerogenus,533 Y Kluyvera cryocrescens,422 Y Enterobacter aerogenes,747 Y Citrobacter freundii,62 Y Enterobacter cloacae, Y Enterobacter cloacae,6 Y Enterobacter cloacae,4 Y Serratia plymuthica,677 Y Serratia odorifera,763 Y Citrobacter amalonaticus,735 Y Enterobacter cloacae,627 Y Enterobacter cloacae,6 Y Kluyvera ascorbata,64 Y Kluyvera ascorbata,3 Y Enterobacter sakazakii,7 Y Enterobacter cloacae,66 Y Enterobacter cloacae,37 Y Enterobacter cloacae,62 Y Serratia plymuthica,32 Y Enterobacter cloacae,21 Y Serratia plymuthica,677 Y Citrobacter freundii,6 Y Serratia fonticola,33 Y Enterobacter cloacae,6 Y Klebsiella pneumoniae,1 Y Escherichia vulneris,7 Y Enterobacter cloacae,66 Y Citrobacter amalonaticus,735 Y Serratia liquefaciens,61 Y Citrobacter freundii,7 Y Serratia marcescens,547 Y Enterobacter cloacae,72 Y Hafnia alvei,47 Y Kluyvera ascorbata,42 Y Klebsiella oxytoca,715 Y Enterobacter cloacae,226 Y Enterobacter cloacae,7434 Y Kluyvera ascorbata,76 Y Serratia plymuthica,32 Y Kluyvera ascorbata,34 Y Citrobacter freundii, Y Escherichia vulneris,6454 Y Klebsiella pneumoniae,54 Y Pantoea agglomerans,656 1

12 Y Serratia spp.,46 Y Enterobacter cloacae,57 Y Citrobacter freundii,771 Y Kluyvera ascorbata,36 Y Pantoea agglomerans,76 Y Enterobacter cloacae,4 Y Citrobacter freundii,4

13 Apéndice A2 Identificación de aislamientos de pocillos amarillos con fluorescencia del método Colilert -/Quanti-Tray Ref. aislamiento Oxidasa Indol Perfil Crystal E/NF Identificación Confianza F Escherichia coli, F Escherichia coli,737 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,67 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,76 F Escherichia coli,76 F Escherichia coli, F Escherichia coli,45 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,67 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,

14 F Escherichia coli,62 F Escherichia coli, F Escherichia coli,3 F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,62 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,3 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,35 F Escherichia coli, F Escherichia coli,45 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli, F Escherichia coli, F Escherichia coli,7 F Escherichia coli,3 F Escherichia coli,67 F Escherichia coli, F Escherichia coli,

15 F Escherichia coli, F Escherichia coli,1 F Klebsiella oxytoca,746

16 Apéndice A3 Identificación de aislamientos de pocillos negativos del método Colilert -/Quanti-Tray Ref. aislamie nto N1 N2 N3 β-gal β-gluc Oxidasa Indol Perfil Crystal E/NF 15 Identificación Confianza N Shewanella putrefaciens,4 N5 N6 N7 N N N1 N N N N N15 N N Shewanella putrefaciens,4 N N1 N2 N21 N22 N23 N24 N25 N26 N27 N2 N2 N3 N31 N32 N33 N34 N35 N36 N37 N3 N3 N4 N41 N42 N43 N44 N45

17 N46 N47 N4 N4 N5 N51 N52 N53 N54

18 Apéndice B: Datos de los estudios sobre la incertidumbre del recuento (véase el apartado 4) Apéndice B1 Incertidumbre del recuento para NMP* de pocillos amarillos sin fluorescencia de un sistema Colilert -/Quanti-Tray inoculado con Klebsiella pneumoniae ATCC 336 *Número Más Probable registrado como números enteros Analista A Lectura Lectura Analista Analista Lectura 1 Lectura 2 B C Repetibilidad Reproducibilidad Muestra NMP NMP NMP NMP Media Desv. DER al Desv. DER al Media Est. cuadrado Est. cuadrado ,,, 2,,, ,,, 6,,, ,,, 1,,, 4,,,,,, ,,, 36,,, ,,, 34,67 1,1547, ,,, 31,,, ,,, 27,,, ,,, 56,,, ,,, 5,,, ,,, 41,,, ,,, 4,,, ,,, 56,,,,,,,,, ,,, 7,,, , 2,24, 6,67 2,34, ,,, 1,,, 7 3,5 7,772,7 5,33 6,35, ,,, 5,,, ,,, 5,,, 21 5, 4,2426,1, 3,4641, , 4,2426,24 7, 3,4641, ,,, 1,,, ,,,,33 4,6, ,,, 5,,, ,,, 5,,, ,,, 21,,, ,,, 5,,, ,,, 5,,, ,,, 21,,, Suma Suma de de DER,7 DER,5 DERc,221 DERc,24

19 Apéndice B2 Incertidumbre del recuento para NMP* de pocillos amarillos con fluorescencia de un sistema Colilert -/Quanti-Tray inoculado con E. coli ATCC 2522 *Número Más Probable registrado como números enteros Analista A Lectura Lectura Analista Analista Lectura 1 Lectura 2 B C Repetibilidad Reproducibilidad Muestra NMP NMP NMP NMP Media Desv. DER al Desv. DER al Media Est. cuadrado Est. cuadrado ,,, 6,,, 2,,,,,, 3,,,,,, ,,, 2,,, ,,, 32,,, ,,, 21,,, ,,, 36,,, ,,, 32,,, ,,, 56,,, ,,, 5,,, ,,, 4,,, ,,, 46, 1,7321, ,,, 7,,, ,,, 7,,, ,,, 66,,, ,,, 7,,, ,,, 5,,, ,,, 1,,, 1,,,,,, 2,,,,,, 21,,,,,, ,,, 5,,, ,,, 7,,, ,,, 74,,, ,,, 1,,, 26,,,,,, ,,, 5,,, ,,, 5,,, ,,, 1,,, 3,,,,,, Suma de DER, Suma de DER, DERc, DERc,6

20 Apéndice C: Recuentos por duplicado de suspensiones de E. coli, Klebsiella pneumoniae y Citrobacter freundii de un sistema Colilert - /Quanti-Tray tras horas y 22 horas de incubación utilizando Colilert- almacenado a 25 C durante 541 días (véase el apartado 5) Días desde fabricación Número de pocillos positivos Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Citrobacter freundii h 22 h % de % de % de h 22 h h 22 h cambio cambio cambio % % + % + % + 1 % + % + 1 % + % + 5 % + 25 % + 15 % + %

21 % + % 2

22 Apéndice D: Intervalos de confianza del 5% y repetibilidad teórica para cada uno de los valores de NMP para el sistema Colilert -/Quanti-Tray de 51 pocillos (véase el apartado 7) Nº de pocillos reacción positiva NMP por 1 ml de muestra Intervalos de confianza del 5% Repetibilidad teórica Desviación Inferior estándar de la Superior repetibilidad Log 1 DE <1,, 3,7 - - Incertidumbre estándar relativa CV% 1 1,,3 5,6,4343 1, 2 2,,6 7,3,371 7,7 3 3,1 1,1,,25 57,7 4 4,2 1,7 1,7,22 5, 5 5,3 2,3,3,143 44,7 6 6,4 3,,,74 4, 7 7,5 3,7 15,5,43 37,,7 4,5,1, ,4, 5,3,,5 33,4 1,1 6,1 2,5,76 31,7,4 7, 22,1, 3,2,7 7, 23,,57 2, 15,, 25,7, 27,,4, 27,5,16 26, 15, 1, 2,4,17 26, 1,2, 31,3,12 25,1 2,7, 33,3,1 24,4 22,2,1 35,2,2 23, 1 23, 15,3 37,3,15 23,1 2 25,4,5 3,4,1 22, ,1,7 41,6,5 22,1 22 2, 1, 43,,3 21,6 23 3,6 2,4 46,3,1 21, ,4 21, 4,7,2 2, 25 34,4 23,3 51,2,5 2, ,4 24,7 53,,7 2, 27 3,4 26,4 56,6,56 1,7 2 4,6 2, 5,5,43 1,4 2 42, 2,7 62,5,3 1,1 3 45,3 31,5 65,6,1, 31 47, 33,4 6,,,6 32 5,4 35,4 72,5,7,4

23 33 53,1 37,5 76,2,71, , 3,7,1,73, 35 5,1 42, 4,4,776, 36 62,4 44,6,,77, , 47,2 3,7,765,6 3 6,7 5,,,761,5 3 73, 53,1,,75,4 4 7,2 56,4 1,2,756,4 41 3,1 5, 1,3,756,4 42,5 63, 6,2,757,4 43 4,5 6,2 5,4,761,5 44,3 73,1 6,,76,7 45 1,1 7,6 15,7,77, 46 1,4 5, 4,5,74,3 47, 2,7 15,,1, 4 4,5,3 224,1,5 1, 4 5,2 5,2 272,2,2 21,4 5 2,5 5, 37,6,14 25,2 51 > 2,5 6,1 infinite - -