NUEVA ISO 11133: 2014 PREPARACIÓN, PRODUCCIÓN, CONSERVACIÓN Y ENSAYOS DE RENDIMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

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1 NUEVA ISO 11133: 2014 PREPARACIÓN, PRODUCCIÓN, CONSERVACIÓN Y ENSAYOS DE RENDIMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO. Pruebas seguras y confiables para los consumidores de alimentos Diana Sofía Ortíz G. Field Marketing Manager BioMonitoring VECO Life Science

2 Introducción y revisión de la norma EN ISO 11133:2014 Por qué realizar control de calidad de Medios de Cultivo utilizando ISO 11133? 2 BAIRD-PARKER AGAR Staphylococcus aureus ATCC 6538

3 Introducción y revisión de la norma EN ISO 11133:2014 Por qué realizar control de calidad de Medios de Cultivo utilizando ISO 11133? o o o o o Los resultados de la prueba microbiana de Agua y alimentos están muy influenciados por la calidad de los medios de cultivo usados La calidad de los medios está influenciada especialmente por la calidad de los componentes biológicos (por ejemplo, peptonas, extracto de carne de vaca, extracto de levadura, agar, etc.) La calidad de los medios de cultivo puede variar de un cliente a otro y de un lote a otro Se necesita un procedimiento estandarizado para el control de calidad de los medios de cultivo ISO describe con precisión la preparación y control de calidad de los medios de cultivo para pruebas de alimentos y agua o Las normas ISO específica como se debe cumplir la norma ISO (y otras, ISO : 2014) 3 BAIRD-PARKER AGAR Staphylococcus aureus ATCC 6538

4 Alta calidad frente a los medios de cultivo de bajo presupuesto Merck Chromocult Listeria Selective Agar (ALOA) Listeria monocytogenes ATCC Agar transparente (buena visibilidad de la zona Halo) Colonias azules con buen tamaño de colonia Formación eficiente de la zona Halo (según las Especificaciones y la ISO 11290) Listeria Selective Agar (ALOA) Listeria monocytogenes ATCC Competidor -Agar transparente (lectura difícil de la zona Halo) - Pequeñas colonias puntuales -> crecimiento deficiente - No hay zona Halo Page 4

5 Contenido de la nueva versión EN ISO 11133: 2014 Durante la revisión, la norma fue completamente reestructurada. Aclarar los procedimientos A establecer una línea clara entre las responsabilidades de los laboratorios y los fabricantes de medios de cultivo en relación con la preparación de los medios de cultivo, producción, almacenamiento y las pruebas de rendimiento. EN ISO reemplaza las especificaciones técnicas publicadas anteriormente de ISO 11133: ISO : 2009 e ISO / TS : 2003 ISO : 2003 s a full EN ISO, it is now a mandatory standard for all ISO Para pruebas microbiológicas de alimentos (humanos/animales) o agua utilizando medios de cultivo en laboratorios acreditados 5

6 Cepas Cepas de Referencia Stock De Referencia Cultivo de Reserva Cultivo de Trabajo Obtenida de una colección de referencia liofilizado al vacío, o un organismo definido hasta género y especie, altamente caracterizado y de origen conocido. Serie de alícuotas de cultivos idénticas obtenidas en el laboratorio por un simple sub-cultivo de la cepa de referencia. Cultivo Primario procedente de un lote de stock de referencia. Subcultivo procedente de un lote de reserva de referencia o de un cultivo de reserva o de un material de referencia (certificado o no).

7 Qué es la CRM CRM Materiales de Referencia Certificados Producidos bajo la guía ISO Guia 34 y certificados de acuerdo a / y ISO Microorganismos de Referencia Certificados CONTROLES!!! American Type Culture Collection Coleccion Española de Cepas 7 ISO 34: Requerimientos Generales para materiales de referencia ISO Evaluación de la conformidad Requisitos generales para los ensayos de aptitud

8 Qué Debe cumplir una cepa CRM? Aplicaciones - QC en agua, alimentos, bebidas, pruebas ambientales - Pruebas de rendimiento de los medios acc. ISO Validación de nuevos métodos Tener caracterización fenotípica y genotípica por métodos validados Debe ser homogéneo y estable Debe tener descripción precisa de Estabilidad, concentración, viabilidad - Materiales para ensayos de aptitud - Desarrollo de métodos - La formación del personal - Cultivos iniciales 8 Company presentation

9 3 Cuáles son los CRMs que comercializamos? LENTICULE discs Vitroids 1. Contienen microorganismos viables en concentración definida. 2. Consisten en bacterias u hongos en una matriz sólida (pellet) soluble en agua. 3. Los microorganismos se encuentran en estado viable y son estables por al menos 1 año. 9 Lenticule : Vitroids:

10 10 Company presentation

11 Pasos para su uso CRMs Remueva vial del freezer -20 o C Lleve a temperature ambiente min Coloque el disco en medios sólido o medio Líquido Re-hidración ocurre en min Disco esta listo para su uso Spread en medio Sólido Mueva en el medio Dispense

12 Gestión de la Garantía de la Calidad de los Medios Preparación de Medios en el Laboratorio Suministrada por el Fabricante/Proveedor Documentación Instrucciones del Fabricante Calidad de los componentes Registros Aceptación de la entrega de Productos Conservación (Sellado, fecha de recepción, fecha de apertura)

13 No: Tarjetas de Control para las Pruebas de Calidad Interna de los Medios de Cultivo Medio de cultivo Volumen Preparado Datos Número de Lote Interno Medio de Cultivo Deshidratado y Código Proveedor Lote Cantidad Fecha / Firma Suplementos Proveedor Lote Cantidad Fecha / Firma Detalles del Proceso Control de Calidad Físico Apariencia esperada del medio de cultivo deshidratado Color Normal Fluye libremente Calidad confirmada Si: No: Defectos: Fecha / Firma Valor de ph esperado Medida de ph Calidad confirmada Si: No: Defectos: Fecha / Firma Cantidad esperado de Llenado y/o espesor de la capa Observado: Calidad confirmada Si: Defectos: Fecha / Firma No: Color esperado Observado: Calidad confirmada Si: No: Defectos: Fecha / Firma Claridad esperada/ Presencia de artefactos ópticos Observado: Calidad confirmada Si: Defectos: Fecha / Firma No: Estabilidad gel esperado / consistencia - Humedad Observado: Calidad confirmada Si: Defectos: Fecha / Firma

14 Calidad de los Componentes Agua purificada: carga microbiana <102ufc/mL (ISO 6222: 22 ±1ºC/68 ±4h) (Destilada, desmineralizada, desionizada o agua producida por ósmosis inversa) Conductividad< 5 μs/cm (máx. 25) (Tipo grado 2-1) Medida del peso y rehidratación: Error máximo de pesada 1% (ISO 7218 e ISO 8199). Los ingredientes se añaden sobre el volumen de agua(no enrasar) Medida y ajuste del ph (antes de autoclavar) Ajuste con NaOH (Hidróxido de Sodio) 1M ó HCl (Ac Clorhídrico) 1M. (Filtrado por membrana de 0.45 o 0.2 micras (filtro tipo Jeringa Millex) Esterilización Calor húmedo (autoclavado) Filtración(0.22 μm) humedecer filtro para evitar retenciones

15 SISTEMA DE PURIFICACION DE AGUA Agua purificada, Tipo 2, ideal para la preparación de medios de cultivo. Elimina sustancias inhibidoras/promotoras de crecimiento microbiano. Tecnología de Electrodesionización - Elix Agua pura con calidad constante y confiable. Menores costos de operación. Valores de resistividad y TOC mejores que el agua producida por doble destilación. Parámetro Valor Unidad Resistividad > 5 25 C Conductividad < 0.2 µs/cm TOC < 30 ppb Bacteria < 0.1 cfu/ml* Partículas > 0.22µm < 1 partícula/ml* * Con filtro final de membrana Millipak Express Millipak Express Filtración directa a 0.22µm, asegurando el agua libre de bacterias y partículas luego de la dispensación. Lámpara UV 254 nm Permite la inhibición de las bacterias presentes en el agua. Control Equipado con tecnologías que permiten una alta precisión en la medición de los parámetros del agua. Manejo intuitivo Sistema de fácil manejo, con dispensadores que permiten visualizar el estado de su sistema. Sencillo mantenimiento y disponibilidad de Guías de referencia rápidas para el Dispensador usuario. Fácil y ergonómica dispensación del agua en su laboratorio. Permite optimizar tiempo y espacio. Dispensación volumétrica o

16 Almacenamiento y Vida Media de los Medios Preparados Medios Comerciales: Instrucciones Fabricante Medios Preparados en el Laboratorio Refrigerados (5+/- 3 C), protegidos de la Luz o desecación (bolsas celofán o plástico). Evaluación Vida Útil: rendimiento físico, químico y microbiológico. Recomendación: 2 a 4 semanas placas y 3 a 6 meses tubos y botellas selladas. *** NO Riesgo sobrecalentamiento!!! Preparación para su Uso: Fusión medios en baño térmico y/o Autoclave a 47 a 50 C (max. 4 h) Vertida en placa C Preparación de Medios para Inoculación: Secado de Placas a C/ 60 a 30 Minutos Microondas Permitido

17 Preparación de medios sólidos en placas de Petri Vierta ml de medio en una placa de Petri (espesor medio de> 3 mm). Puede requerirse más medio para incubación más larga (> 72 h) o mayor temperatura de incubación (> 40 C) Preparación de medios de cultivo para inoculación Para la inoculación superficial de medios de cultivo sólidos, se secan las placas poco antes de su uso hasta que las gotas desaparezcan de la superficie del medio. Secado de Placas a C/ 60 a 30 Minutos

18 Microorganismos de Ensayo para Pruebas de Rendimiento Criterios de Selección Cepas Positivas (Características típicas del microorganismos diana) Cepas débilmente Positivas. Cepas negativas Cepas completa o parcialmente inhibidas El anexo E contiene los microorganismos de prueba que se utilizarán en microbiología alimentaria. El anexo F contiene los microorganismos de prueba que se utilizarán en microbiología del agua. WDCM: Cepas de catálogo de identificadores en los compilados universales por el Centro Mundial de Datos para Microorganismos (WDCM). Selectividad Especificidad Productivodad

19 Microorganismos para pruebas de rendimiento Anexo E y F: Selección de organismos de prueba? Selección de microorganismos de ensayo para cada medio por proveedor comercial / no comercial: Necesidad de usar todas las cepas de QC listadas para un medio dado Selección de microorganismos de ensayo para cada medio: Necesidad de utilizar cepas mínimas como se indica por la letra "b" para un medio dado 19 Footnotes: b Cepas que se utilizarán como mínimo D - cepa libre de elección; Se debe utilizar una cepa H - E. coli WDCM es un productor de ß-D-glucuronidasa fuerte, WDCM es un productor débil

20 Microorganismos para pruebas de rendimiento Microorganismos para pruebas de rendimiento - Inoculación e incubación Nivel del inóculo para pruebas de productividad - Pruebas cuantitativas: ~ 100 ufc es necesario para lograr una precisión suficiente; Esto puede requerir el uso de más de una réplica de placa. Se debe utilizar un rango práctico de 80 cfu cfu por placa con un número mínimo de 50 cfu / placa. Para los filtros, se necesita el mismo número de cfu usando uno o más filtros a 10 4 ufc para diluyentes y medios de transporte líquidos Nivel del inóculo para pruebas de productividad - Pruebas cualitativas cfu para pruebas cualitativas de medios de placa, 100 cfu para pruebas de productividad de medios de enriquecimiento previo y enriquecimiento, 10 4 a 10 6 ufc para pruebas cualitativas de medios de transporte sólidos. Nivel del inóculo para la selectividad y para la prueba de especificidad 10 4 to 10 6 del microorganismo no objetivo para pruebas de selectividad 10 3 a 10 4 ufc del microorganismo diana son necesarios para las pruebas de especificidad. Debe utilizarse Tiempo de incubación más corto MCO. Objetivo Tiempo de incubación más largo para determinar la selectividad.

21 Métodos para pruebas de rendimiento de medios de cultivo sólido Productividad: Inoculo: Concentración conocida Medios Cultivo Prueba para Rto Medios Cultivo REFERENCIA no selectivo PR: coeficiente de productividad NS: recuento total de colonias obtenidas en o en el medio de cultivo sometido a prueba N0: recuento total de colonias obtenidas en el medio de cultivo definido de referencia (Aprox 100 cfu) Adicional en Merck de manera voluntaria ASEGURANDO CALIDAD N 0 N S

22 Métodos para la prueba de rendimiento de medios de cultivo líquido Cualitativas - Medios líquidos selectivos = M.O Diana M.O NO Diana Mezcla M.O NO Diana Incubación a condiciones adecuadas del medio/m.o. Tomar 10ul Medios Cultivo ESPECIFICO Medios Cultivo NO especifico

23 Resultados La productividad del caldo selectivo es satisfactoria si se obtiene al menos % crecimiento de microorganismos diana sobre el medio especıfico para ese organismo (por ejemplo, XLD) % No selectivos La selectividad del caldo de ensayo es satisfactoria si no se produce crecimiento de microorganismos no diana en la placa de agar no selectiva (TSA)

24 Nueva ISO (2014) Nuevo Método de referencia ISO (2014) Nueva ISO demandas cada prueba de cada lote de filtro con cada lote de medio de cultivo Validación de Agar Chromocult Coliformes (CCA) en aguas portables/piscinas/ bebidas 24 24

25 Nuevo Método de referencia ISO (2014) Influencia de la calidad del filtro de membrana en la recuperación de Coliformes Brand 1 Brand 2 Brand 3 Brand 4 Millipore EZHAWG474 E. coli ATCC C. koseri ATCC S. marcencens ATCC

26 ISO 6579:2017 Microbiology of the food chain -- Horizontal method for the detection, enumeration and serotyping of Salmonella Part 1: Detection of Salmonella spp

27 Esterilidad de Medios de Cultivo Determinar la efectividad de las esterilizaciones con vapor a 121 C por 15 minutos. Sterikon plus Bioindicador Ampollas de caldo nutritivo y esporas de un organismo no patógeno, Geobacillus stearothermophilus ATCC La resistencia térmica es tal que las esporas mueren totalmente después de 15 min a una T:121 ± 0,5 C (15 PSI/1 bar). Después de autoclavar, se procede a revisar el proceso de esterilización por incubación a 60 C ± 2 C a 24h. de las ampollas. Si no hay crecimiento de Geobacillus stearothermophilus indica que la esterilización fue adecuada, cuando se muestra crecimiento la esterilización fue inadecuada.

28 STERIKON PLUS Especificaciones de esterilizacion por vapor T 121 C) USP 34 Sterikon 1.) Numero de esporas por unidad 5 x 10 5 to 5 x x 10 5 to 1x10 7 antes de la esterilización 2.) D-valores en minutos 1.5 to max. 3.0 (min) 1.5 to 2.0 (min) 3.) F-valores en minutos 15.0 to max. 30 (min) 15.0 (min) D = Tiempo de reducción decimal (Tiempo en minutos en la cual a una T definida reduce el numero de microorganismos por un factor de 10) F = Muerte térmica ( Menor tiempo en minutos para matar todas las esporas en una suspensión especifica a una temperatura definida)

29 Medios de Cultivo Merck GranuCult GranuCult tiene nuevos Certificados de Análisis Información importante para los clientes incluidos: Promoción del crecimiento de acuerdo con las Versión de DIN EN ISO Todas las cepas de QC se enumeran en la nueva EN ISO 11133: 2014 y en normas ISO específicas (por ejemplo, ISO 6579). Todas las cepas QC acorde a WDCM y ATCC (no es necesario buscar la referencia cruzada) Dependiendo del medio, las cepas adicionales se incluyen en las pruebas de control de calidad (incluyendo cepas débilmente positivas) CoA actualizados: Acreditación ISO de Darmstadt 29 QC Lab

30 Nuevo GranuCult Plate Count Nuevo Certificado de Análisis acorde a la acreditación Darmstadt 30 CoA pag 1

31 Nuevo GranuCult Plate Count Todas las cepas de QC listadas en la nueva norma EN ISO y las normas ISO específicas (por ejemplo, ISO 4833, ISO 17410) Cepas para desafiar el rendimiento de PCA CoA pag 3 31 CoA pag 2

32 Agar Plate Count Marca? Cumplimiento de normas ISO? No mencionadas Se refiere a la anterior ISO desactualizada para el uso de cepas de control S. aureus no acorde a la ISO actualizada (WDCM00034 / ATCC 25923) La indicación solo de cepas ATCC es inconveniente para los clientes

33 Conclusiones: ISO 11133: 2014 se convirtió en el estándar regulador más importante para los medios de cultivo de calidad asegurada en pruebas de alimentos y agua ISO 11133: 2014 mejorará la seguridad del consumidor. ISO 11133: 2014 se aplica no sólo en los EE.UU., sino también en muchos países fuera de los EE.UU. Para los laboratorios acreditados ISO 17025, ISO 11133: 2014 es obligatorio. Merck como el proveedor líder de medios de cultivo de F&B ha actualizado completamente el portafolio de medios de cultivo y la documentación de acuerdo con las más recientes normas ISO y Cepas CRM Merck proporciona la documentación de cumplimiento más completa y herramientas útiles de búsqueda de productos para servir a los clientes con la información de cumplimiento requerida para los medios de cultivo. 33

34 GRACIAS La seguridad es más compleja de lo que parece Soluciones para evaluación microbiológica By Merck.