COPROCULTIVO: Remitir el hisopo en medio de transporte (Stuart, Cary Blair o similar) MATERIA FECAL: Enviar aproximadamente 5 g en frasco estéril

Transcripción

1 Instrucciones para el envío de muestras de origen clínico para aislamiento de Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) en casos de diarrea o Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) COPROCULTIVO: Remitir el hisopo en medio de transporte (Stuart, Cary Blair o similar) MATERIA FECAL: Enviar aproximadamente 5 g en frasco estéril AISLAMIENTOS: Enviar repiques en agar blando o en tripticasa de soya SUERO: Enviar 500 µl de suero en tubo seco DATOS DEL PACIENTE: Enviar el Anexo I o II (notificación) según corresponda OBSERVACIONES: Las muestras deben ser enviadas según las Normas de Bioseguridad que corresponden al transporte de muestras clínicas.

2 SIM AISLAMIENTO Y CARACTERIZACION Manual o Automatizada PCR () Materia fecal Test inmunocromatográfico Cultivo en SMAC (directo y después de enriquecimiento) Seroagrupamiento presuntivo Tamizaje por PCR Múltiple stx1/stx2/rfbo157 Caracterización fenotípica y genotípica Tipificación RESULTADO

3 Hisopado rectal Siembra directa Caldo Caldo CTS con CTS cefixima 0,05 mg/l y telurito de potasio 2,5mg/l Agar SMAC Incubación a 37º por 6 hs..... Agar SMAC...

4 Color Turquesa

5 CHROMAGAR Aislamiento y diferenciación directa de E.coli O157 por colonias coloreadas Interpretación E.coli O157 malva Otras bacterias Azul, transparentes o inhibidas

6 DETECCIÓN LPSO157 Test de Inmunocromatografía Merck Dupont Rapid Chek Reveal

7 DETECCION DE Stx Test de inmunocromatografía RIDA QUICK Verotoxin O157 Combi (Bioart) Requerimientos Cultivo en caldo mtsb + Mitomicina C 18 h 37 C Duopath Verotoxin (Merck) Requerimientos Cultivo en placa SMAC 18 h 37 C + polimixina B

8 Seroagrupamiento O157 Fundamento: los anticuerpos antio157 aglutinan en presencia del antígeno O157 del LPS bacteriano. Realizar test de aglutinación en SF para descartar autoaglutinación Reacciones cruzadas con: Salmonella Urbana O:30; Yersinia enterocolitica O:9; Yersinia pseudotuberculosis O:IB; Citrobacter freundii; Escherichia hermanii; Haffnia spp. y Brucella abortus

9 PCR Multiplex stx1 1 / stx2 2 / rfbo bp 259 bp 130 bp Leotta GA, Chinen I, Epszteyn S, Miliwebsky E, Melamed IC, Motter M, et al. Validación de una técnica de PCR multiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga. Rev Argent Microbiol 2005; 37: 110.

10 Metodología para la detección y aislamiento de E. coli O157 Separación inmunomagnética

11 Metodología para la aislamiento de E. coli O157 Separación inmunomagnética

12 Escherichia coli productor de toxina Shiga Pruebas Bioquímicas TSI: Pico ácido/fondo ácido con producción de gas, SH2 negativo 2.Utilización del Citrato: negativo 3.SIM: SH2 negativo, Indol: positivo, movilidad: positiva 4.LIA: decarboxilación de la lisina positiva, SH2: negativa 5.Fermentación de celobiosa: negativa

13 Esquema de diferenciación entre Escherichia coli y Escherichia hermanii Prueba Fermentación de celobiosa Crecimiento en KCN Pigmento amarillo Lisina decarboxilasa E. coli (2%)* (3%) (0%) + (90%) E. hermanii + (97%) + (94%) + (98%) (6%)

14 Siembra del 1º pasaje Siembra del segundo pasaje Cepa Móvil Cepa no Móvil

15 Biotipificación de Escherichia coli O157:H7 Prueba Biotipo A B C D % (+) de otros Escherichia coli ßglucuronidasa 96 Sorbitol 95 Rafinosa Dulcitol Ramnosa

16 Actividad de βglucuronidasa y Biotipificación de E. coli O157 STEC O157:H7 Biotipo C Actividad βglucuronidasa: negativa 2.Fermentación del sorbitol: negativa 3.Fermentación de rafinosa: positiva 4.Fermentación de dulcitol: positiva 5.Fermentación de ramnosa: positiva

17 Seroagrupamiento STEC noo157 Incubar colonias Stx positivas en un medio rico de cultivo Preparar y hervir suspensión bacteriana Realizar seroagrupamiento en placa con antisueros polivalentes y monovalentes como el anti: O26, O91, O103, O111, O113, O121, O145, O174 etc.

18 Técnicas diagnósticas utilizando cultivo celular Detección de toxina Shiga libre en Materia Fecal (StxMF) Estas técnicas son utilizadas en Laboratorios de Referencia

19 LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA CLINICA RESULTADO POSITIVO NEGATIVO Informar al médico Realizar control de excreción y control de contactos familiares e Institucionales indicados por epidemiología Enviar muestras del aislamiento, materia fecal y suero al LNR Informar al médico Realizar control de contactos familiares indicados por epidemiología Enviar muestras de materia fecal y suero al LNR

20 LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA CARACTERIZACION DE STEC Tipificación: Factores de virulencia: toxinas Stx, proteína intimina y enterohemolisina (PCR) Biotipo Serotipo Antibiotipo Subtipificación: PFGE Genotipificación de variantes de Stx Genotipificación de la proteína intimina Fagotipificación cepas O157

21 LABORATORIO NACIONAL DE REFERENCIA PARA SUH Y DIARREAS POR STEC Patógenos estudiados STEC O157 y noo157 Tipificación y Subtipificación de cepas humanas, de animales y alimentos incorporada a la Vigilancia Epidemiológica Investigación de Brotes