Guía Práctica 9. Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN. Micelio de hongos. Contenido

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1 Guía Práctica 9 Micelio de hongos Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN Guillermo Castellanos, Experto en Investigación 2 Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigación Gloria Mosquera, Fitopatóloga, Ph.D., Líder de Proyecto Fitopatología de Frijol Contenido Generalidades 9-2 Procedimientos 9-3 A. Producción de micelio 9-3 B. Cosecha del micelio 9-5 C. Extracción del ADN del micelio 9-8

2 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Generalidades Un punto clave en la extracción de ADN de buena calidad del micelio de hongos fitopatógenos es el crecimiento óptimo del micelio sobre un medio de cultivo. Se utiliza, generalmente, este tipo de tejido del hongo porque tiene un crecimiento más homogéneo que otros tejidos del hongo. Las esporas, por ejemplo, son más difíciles de procesar que el micelio, porque son estructuras muy rígidas que requieren protocolos de extracción especiales; además, pertenecen, por su formación, a la etapa madura o senescente del crecimiento del hongo. Para lograr un buen crecimiento del micelio de un hongo es necesario aplicar las buenas prácticas microbiológicas (BPM), entre ellas las siguientes: esterilidad identificación correcta de las muestras cultivo del hongo en la fase exponencial de crecimiento 9-2

3 Guía Práctica 9: Micelio de hongos Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN Procedimientos A. Producción de micelio Materiales para el medio líquido Dextrosa o sucrosa 20 g Extracto de levadura 5 g Peptona 5 g Agua destilada 1 litro Preparación Calentar el litro de agua destilada con los ingredientes para facilitar su mezcla, hasta que la solución adquiera un color amarillo y se vea cristalina: esta mezcla es el medio líquido. Preparar 20 frascos erlenmeyer de 250 ml (cada uno recibe 50 ml de la mezcla anterior). Tapar cada uno de los frascos erlenmeyer con los siguientes elementos: tapón de algodón, papel de aluminio, papel de envolver y banda de caucho. Llevar los frascos erlenmeyer al autoclave y esterilizarlos. Una vez preparado el medio líquido, se ejecutan los cuatro pasos del proceso de producción. 9-3

4 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Pasos del proceso Se toman los diferentes aislamientos de hongos que serán utilizados para producir micelio, los cuales han crecido previamente en cajas petri que contengan el medio de cultivo adecuado. Se comprueba luego que hayan esporulado y que estén totalmente puros (es decir, libres de otros microorganismos contaminantes). En estos procesos se utilizan pipetas pasteur estériles y todos los procesos se ejecutan en la cámara de flujo laminar. Paso 1 Marcar el frasco erlenmeyer con el nombre del aislamiento que va a crecer en este medio. Proceder luego de la siguiente manera: retirar de los frascos erlenmeyer la banda de caucho, los pedazos de papel de envolver y el tapón de algodón, y colocarlos a un lado evitando que se contaminen, ya que serán reutilizados en el paso siguiente. Paso 2 Tomar con la pipeta 5 ml de medio líquido del frasco erlenmeyer, depositarlo sobre el hongo en crecimiento en una caja petri y raspar su superficie con la pipeta; de este modo se hace una suspensión con el micelio y las esporas del aislamiento. 9-4

5 Guía Práctica 9: Micelio de hongos Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN Paso 3 Aspirar con la pipeta la suspensión obtenida y colocarla de nuevo en el frasco erlenmeyer de donde se extrajo el medio líquido (paso anterior). Inmediatamente después tapar el frasco erlenmeyer colocando en él de nuevo el tapón de algodón, los pedazos de papel de envolver y la banda de caucho que se habían reservado. Paso 4 Colocar los frascos erlenmeyer en un agitador a 80 rpm durante 10 días a temperatura ambiente (22 C). Este tiempo es suficiente para que crezca el micelio, que se cosechará más tarde. Durante la agitación, el medio debe conservar su estado cristalino. Si se ve turbio, está contaminado; se debe descartar ese aislamiento y repetir todo el proceso. B. Cosecha del micelio Materiales Frascos de vidrio con tapa rosca, que se esterilizan en autoclave Toallas de papel esterilizadas en autoclave Gasa cortada en cuadros de 15 x 15 cm y esterilizada en autoclave Cinta de enmascarar delgada Marcador de punta fina y recipiente de vidrio para desechar el medio de cultivo líquido donde creció el hongo 9-5

6 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Pasos del proceso Foto 1 Foto 2 Foto 3 Foto 4 Paso 1 Retirar de cada frasco erlenmeyer la banda de caucho, los trozos de papel y el tapón de algodón (Foto 1). Paso 2 Colocar en la boca de cada frasco erlenmeyer un cuadrado de gasa, sujetarlo allí con los dedos por sus bordes (puede ayudarse con una varilla de vidrio esterilizada) e inclinar el frasco erlenmeyer sobre un vaso grande para que salga el medio líquido a través de la gasa (Foto 2). De este modo se filtra el medio y se retiene en la gasa el micelio que creció dentro del frasco erlenmeyer (Foto 3). Paso 3 Retirar la gasa con el micelio de la boca del frasco erlenmeyer y depositarlo sobre dos toallas de papel (Foto 4). Enrollar las toallas sobre el micelio y hacer presión con los dedos para extraerle el remanente de medio de cultivo líquido (Foto 5). Paso 4 Tomar el frasco de vidrio con tapa rosca donde se almacenará el micelio y marcarlo con el nombre del aislamiento usando cinta de enmascarar (Foto 6). Foto 5 Foto 6 9-6

7 Guía Práctica 9: Micelio de hongos Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN Paso 5 Depositar el micelio secado con las toallas en el fondo del frasco de vidrio, ya marcado, con la ayuda de una espátula esterilizada pequeña (Foto 7). Colocar luego la tapa del frasco (Foto 8) dejando éste a medio cerrar (no enroscar totalmente la tapa). Paso 6 Llevar los frascos que contienen el micelio y que están aún con la tapa floja al liofilizador (ver descripción en otras guías) y dejarlos allí durante 24 horas para que termine de secar el micelio (Foto 9). Pasado ese tiempo de secado, apagar el liofilizador, retirar de él los frascos y ajustar sus tapas. Foto 7 Foto 8 Si no se procede enseguida a extraer el ADN del micelio, los frascos con micelio se almacenarán a 80 C (Foto 10). Foto 9 Foto

8 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol C. Extracción del ADN del micelio Materiales (soluciones) Acetato de amonio 7.5 M PM = (CH 3 COO NH 4 ) Preparación de 500 ml de solución: Diluir 289 g de acetato de amonio en 300 ml de agua destilada estéril. Cuando el acetato esté completamente disuelto, ajustar el volumen de la solución a 500 ml. Esterilizar la solución mediante filtros de 0.22 μm. Almacenar a temperatura ambiente (RT). Buffer de extracción Soluciones stock : Solución stock [Inicial] a Volumen usado [Final] a (ml) NaCl 5 M M Tris-HCl, ph M M EDTA, ph M 4 10 mm Compuesto SDS b (2 g) 1% a. Concentraciones inicial y final (está en los 200 ml, ver abajo). b. SDS = dodecil-sulfato sódico, compuesto tensoactivo aniónico. 9-8

9 Guía Práctica 9: Micelio de hongos Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN Preparación de 200 ml de buffer: Disolver el SDS (2 g) en 80 ml de agua destilada estéril tibia. Adicionar las soluciones stock como indica el cuadro arriba y ajustar el volumen a 200 ml con agua destilada estéril. Guardar a temperatura ambiente (RT). Proteinasa K [10 mg/ml] Referencia: Proteinasa K, Promega Cat# V mg Preparación: Stock 1 [20 mg/ml] Reconstituir 5 ml de una solución de Tris HCl 50 mm, ph 8.0 y de una de CaCl 2 10 mm, así: Tomar 250 μl del stock 1 M Tris-HCl ph 7.5 Añadirle 50 μl de un stock 1 M CaCl 2 Ajustar el volumen a 5 ml Stock 2 [10 mg/ml] Diluir 5 ml del stock 1 anterior con 5 ml de gricerol al 100%, para obtener una solución de glicerol al 50%. Alicuotar la solución anterior en microtubos de 1.5 ml y almacenarlos a 20 C. La concentración usual de trabajo de la proteinasa K está entre 50 y 100 μg/ml. 9-9

10 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol 1X TE ph 8.0 Soluciones stock : Solución stock [Inicial] a Volumen usado [Final] a (ml) Tris-HCl, ph M 5 10 mm EDTA, ph M 1 1 mm a. Concentraciones inicial y final (está en los 500 ml, ver abajo). Preparación de 500 ml de solución: Ajustar el volumen (6 ml) hasta 500 ml con agua destilada estéril. Esterilizar esta solución por filtración (poros de 0.22 μm). Tomar alícuotas en microtubos de 1.5 ml y guardarlos a 4 C. RNAasa A [1 mg/ml] Referencia: RNAasa A Roche 100 mg Preparación: Stock 1 [10 mg/ml] Resuspender todo el contenido de la enzima en 10 ml de una solución 10 mm de Tris-HCl, ph 7.5 (100 μl de 1 M Tris-HCl) + 15 mm NaCl (37.5 μl de 1 M NaCl) Calentar esta suspensión a 100 C durante 15 minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente y tomar alícuotas. 9-10

11 Guía Práctica 9: Micelio de hongos Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN Stock 2 [1 mg/ml]: Diluir 100 μl del stock 1 anterior con 900 μl de solución 10 mm Tris-HCl ph mm NaCl (37.5 μl 1 M NaCl). Hacer alícuotas y almacenarlas a 20 C. Tris-HCl 1 M Partiendo de Trizma Base: PM = Preparación de 1000 ml de solución: Disolver g de Trizma Base en 800 ml de agua destilada. Ajustar el ph al valor deseado adicionando HCl concentrado. Completar a 1 litro con agua destilada y esterilizar en autoclave. Guardar a 4 C. NaCl 5 M PM = Preparación de 500 ml de solución: Disolver g de NaCl en agua destilada. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente. 9-11

12 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol EDTA 0.5 M ph 8.0 PM = Preparación de 1000 ml de solución: Disolver g de EDTA en 800 ml de agua destilada; usar un agitador magnético. Ajustar el ph hasta 8.0 con NaOH (~20 g) y completar el volumen a 1000 ml. El EDTA se disuelve bien cuando la solución alcanza el ph apropiado. Esterilizar en autoclave y guardar a temperatura ambiente. Acetato de sodio 3 M ph 5.2 PM = (anhidro) (CH 3 COO Na) Preparación de 100 ml de solución: Disolver g de acetato de sodio en 80 ml de agua destilada. Ajustar el ph hasta 5.2 con ácido acético glacial y completar el volumen a 100 ml. Esterilizar en autoclave y guardar a temperatura ambiente. 9-12

13 Guía Práctica 9: Micelio de hongos Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN Proceso de extracción La extracción del ADN del micelio de los hongos fitopatógenos considerados en estas guías comprende los siguientes pasos: 1. Precalentar el buffer de extracción a 65 C al baño María. 2. Adicionar al buffer la Proteinasa K [10 mg/ml] hasta obtener una concentración final de 30 µg/ml. Adicionar, por tanto, 3 µl de Proteinasa K por cada ml de buffer, lo que equivale a tomar 2.1 µl de Proteinasa K por 700 µl de buffer. 3. Macerar el micelio fresco o almacenado (ver protocolo anterior) empleando nitrógeno líquido. Pasar el micelio macerado a tubos eppendorf de 1.5 ml con la ayuda de un pistilo, llenándolos hasta la marca de 100 o 150 µl. 4. Adicionar a cada muestra (tubo de 1.5 ml) 700 µl del buffer de extracción con Proteinasa K preparado en el Paso 2. Homogeneizar la mezcla mediante vórtex o mezclador de tubos e incubar al baño María a 65 C durante 1 hora, como mínimo. 5. Mezclar por inversión manualmente cada 20 o 30 minutos. 6. Hay dos opciones en este paso: Después de la incubación (Paso 4), agregar 0.5 volúmenes del acetato de amonio 7.5 M preparado antes, mezclar por inversión del tubo e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. 9-13

14 Guías Prácticas de Laboratorio para el Manejo de Patógenos del Frijol Después de la incubación (Paso 4), mezclar nuevamente y agregar un volumen igual (700 µl) de la solución de fenol, cloroformo e isoamilalcohol (25:24:1) y mezclar con vórtex. Esta solución fenólica debe manipularse en cámara extractora evitando inhalar los vapores que desprende. 7. Centrifugar a temperatura ambiente a rpm durante 10 minutos. 8. Rescatar el sobrenadante, teniendo cuidado de no tomar la interfase, y pasarlo a un nuevo tubo eppendorf de 1.5 ml. 9. Adicionar 1 volumen igual de una solución de cloroformo y alcohol isoamílico (24:1) y centrifugar a rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. La solución debe estar a temperatura ambiente al momento de usarla y debe manipularse en cámara extractora evitando inhalar los vapores que desprende. 10. Rescatar el sobrenadante y pasarlo a un nuevo tubo eppendorf de 1.5 ml. 11. Paso opcional: Agregar acetato de sodio 3 M de ph 5.2 (1/10 del volumen del sobrenadante) y homogeneizar manualmente por inversión. 12. Agregar isopropanol frío en una relación 1:1 y homogeneizar suavemente por inversión del tubo manualmente. 13. Incubar a 20 C durante toda la noche. 9-14

15 Guía Práctica 9: Micelio de hongos Producción de micelio en medio líquido para extracción de ADN 14. Centrifugar a rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante invirtiendo el tubo, teniendo cuidado de no perder la bolita ( pellet ) de ADN. 15. Lavar el pellet con 800 µl de etanol al 70%, frío y centrifugarlo a rpm durante 5 minutos. 16. Descartar el sobrenadante y secar el pellet por inversión del tubo, a temperatura ambiente. 17. Diluir el pellet en el buffer 1X TE ya preparado (usualmente, en 100 µl) añadiendo 2 µl de RNAasa [1 mg/ml] e incubar a 37 C durante una hora, como mínimo. Recomendación: Resuspender el pellet durante toda la noche a 4 C con 1X TE, y al día siguiente adicionarle la RNAasa; incubar luego a 37 C. 18. Almacenar el ADN a 20 C. 9-15

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