PRÁCTICO N 3. Técnicas para la observación, aislamiento y conservación de microorganismos

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1 PRÁCTICO N 3 Técnicas para la observación, aislamiento y conservación de microorganismos

2 Objetivos Conocer el manejo del microscopio óptico, sus partes y utilidad en el laboratorio de microbiología. Conocer las técnicas básicas para la realización de coloraciones simples y dobles. Ser capaz de explicar el fundamento de la coloración de Gram y mencionar sus utilidades diagnósticas. Conocer las técnicas de aislamiento de microorganismos para obtener cultivos puros. Adquirir habilidad para la observación de microorganismos. Adquirir habilidad en el aislamiento de microorganismos en medio sólido. Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal.

3 Métodos de coloración y observación de microorganismos Características del microscopio óptico Aumento: objetivo x ocular Resolución: objetivo de inmersión (aceite de inmersión) Tipos de microscopios ópticos Campo claro Contraste de fases Campo oscuro Fluorescencia

4 Tipos de preparaciones para observación en microscopio ópticos Preparaciones húmedas Preparaciones fijadas

5 Métodos de coloración Objetivo: Aumentar el contraste de los microorganismos con el fondo. Tipos de colorantes Catiónicos: - azul de metileno - cristal violeta - safranina Aniónicos: - fucsina ácida - rojo congo

6 Coloraciones simples Tipos de coloración Preparación y fijación de un extendido por calor Coloración Observación

7 Secuencia de una coloración simple Equipo de coloración Flamear un portaobjeto Esterilizar el ansa Extraer una alícuota Extender Fijar al calor

8 Secuencia de una coloración simple (cont.) Agregar el colorante Esperar un minuto Lavar Secar Observar

9 Secuencia de una coloración simple (fijación con ácido) Portaobjeto enterrado Colorear con fucsina Esperar 5 minutos Fijación con ácido acético Actividad: colorear con fucsina los cultivos de suelo (fijado por calor) y el portaobjeto enterrado (fijado con ácido acético).

10 Coloración simple (Rossy-Cholodny) Hongo tabicado Partícula de arena Bacterias Actinomycetes Hongos

11 Coloraciones Diferenciales (Gram) 1) Teñir el extendido con Cristal Violeta (1 minuto) Todas las bacterias se tiñen de violeta Gram + Gram - 2) Añadir Lugol para fijar el colorante (1minuto) 3) Decolorar el extendido con alcohol acetona. Se enjuaga con agua. Las bacterias G + quedan violetas y las G se decoloran 4) Teñir el extendido con fucsina (30 segundos). Enjuagar con agua. Las bacterias G + quedan violetas y las G rosadas

12 Coloración diferencial (Gram) Actividad: realizar una coloración diferencial Bacterias G- Bacterias G+

13 Obtención de cultivos puros Cultivo puro: conjunto de microorganismos genéticamente iguales. Aislamiento: procedimiento que permite separar un microorganismo de una población mixta. Métodos de aislamiento Aislamiento en medio sólido: Consiste en separar e inmovilizar individuos en un medio solidificado. Aislamiento biológico: Consiste en inocular animales o vegetales y aislarlas de la sangre, tejidos, etc.

14 Aislamiento en medio sólido por estriado Fundir el agar Colocar en caja de Petri Dejar solidificar Esterilizar el ansa Trazar estrías sobre el agar Incubar

15 Actividad: realizar aislamiento por agotamiento (estrías) Colonias aisladas Crecimiento confluente Cultivos puros en caja de Petri

16 Conservación de cultivos puros Formas de conservación de cultivos puros Liofilización: desecación mas congelación Congelación: -90 C recubierto con glicerol

17 Subcultivos seriados: repiques periódicos ( 4-5 C)

18 Síntesis del práctico N 3 Técnicas microbiológicas Normas de manejo en microbiología Observación Aislamiento Conservación Asepsia Microscopio Óptico Medio sólido (estrías) Liofilización Atmósfera Tipos de Colorantes Catiónicos Biológico (vegetales o animales) Congelación Subcultivos seriados Sup. de trabajo Aniónicos Manejo de material y recipiente Tipos de Coloración Simples Diferenciales

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