MÉTODOS CLÁSICOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS. GUIÓN DE PRÁCTICAS

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1 MÉTODOS CLÁSICOS DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS. GUIÓN DE PRÁCTICAS AGUSTÍN LEÓN ALONSO-CORTÉS TECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS Normas Generales Preparación y manejo del material de laboratorio Recuento de aerobios mesófilos Recuento de enterobacterias totales Recuento de coliformes Recuento de estreptococos fecales Identificación de enterobacterias. Tira API 20 E Tinciones BIBLIOGRAFÍA

2 NORMAS GENERALES PARA EL ALUMNO 1.- Cada alumno asistirá dentro del grupo y puesto de trabajo asignado, sin posibilidad de cambio, pues cada puesto dispone de material en relación con el número de alumnos en él comprendidos. 2.- Las prácticas comenzarán a las horas indicadas en la convocatoria previa. Sea puntual en beneficio de todos. 3.- El alumno vendrá provisto de la bata correspondiente, así como de un rotulador marcador en vidrio y mechero. 4.- El material de que dispone debe ser tratado con sumo cuidado. Es costoso y va a ser utilizado también por sus compañeros. 5.-Va a manejar, en muchas ocasiones, productos contaminados por microorganismos patógenos, peligrosos para Vd. y para los demás. Evite el peligro de contaminación, realizando el trabajo atentamente y de la forma que se indica en el manual. 6.- No se puede fumar en la zona de prácticas. 7.- Deje todo el material en el mismo orden que Vd. lo encontró. 8.- Al terminar su tarea, debe lavarse las manos antes de salir del laboratorio. PREPARACION Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO Es de gran importancia en Microbiología la limpieza de todo el material que se va a utilizar, debido a los problemas de contaminación que la suciedad pueda ocasionar. Todo el material sucio especialmente las placas de Petri desechables ya utilizadas, deben recogerse en recipientes o bolsas adecuadas para evitar la contaminación del laboratorio, para lo cual deben ser esterilizadas en el autoclave durante 20 minutos a 121ºC de temperatura. El material de vidrio, plástico o metal utilizado debe lavarse con detergente, enjuagado con agua destilada y secado a temperatura ambiente. Los cubre y portaobjetos una vez que han sido lavados adecuadamente, se sumergen en mezcla crómica durante horas. Transcurrido este tiempo, se lavan con agua destilada y se secan para su posterior uso. Las pipetas de vidrio reutilizables deben limpiarse y desinfectarse utilizando un lavador de pipetas donde previamente hayamos añadido una solución detergente, una vez enjuagadas se disponen en paquetes de varias unidades envueltos de papel aluminio y se esterilizan en un autoclave u horno. Para la limpieza de los tubos de ensayo, primero se desprende el medio que contienen ayudándose de un escobillón y a continuación se lavan con agua y detergente, se enjuagan con agua destilada y se dejan secar en posición invertida. Cuando se decide su utilización, se llenan con el medio de cultivo y se esterilizan en el autoclave. Antes de introducirlos, se tapan y se colocan en cestillos apropiados.

3 Los frascos Erlenmeyer, matraces, etc., se taponan de igual forma que los tubos de ensayo, con algodón graso y se esterilizan, tomando la precaución de colocarles previamente en una bolsa de plástico autoclavable para evitar que el posible derramamiento de su contenido durante el tratamiento térmico ensucie o tapone los conductos de nuestro autoclave. Las operaciones como toma de muestra, siembras, resiembras, diluciones, aislamientos, etc., se deben hacer de manera que se evite toda contaminación, trabajando en la proximidad del mechero o en cabina de flujo laminar. Las asas y agujas que se utilizan para siembras e inoculaciones deben esterilizarse antes y después de su uso, calentándolos a la llama del mechero hasta el rojo. Para evitar salpicaduras del material, el instrumento se va introduciendo gradualmente en la llama. Operaciones de manipulación de tubos y placas: En general Las placas Petri, en el momento de su uso se deberán entreabrir el tiempo mínimo requerido para la manipulación a realizar, realizándose ésta siempre bajo la llama del mechero. Las operaciones que se repetirán con frecuencia en el laboratorio son: Pipeteado tubo-placa. Pipeteado tubo-tubo. Preparación de un Medio de Cultivo Los medios de cultivo que se utilizan en el laboratorio para el crecimiento de microorganismos pueden elaborarse utilizando los productos químicos descritos en cualquier catálogo o libro especializado con la ayuda de una balanza analítica, o bien ser encargados en su forma deshidratada a cualquiera de las casas proveedoras (DIFCO, API, OXOID, etc.). Es obvio que esta última alternativa resulta más cara, pero también es más cómoda. Una vez que tenemos el medio, para su preparación, debemos seguir los pasos indicados en la etiqueta, los cuales consisten básicamente en hidratar una cierta cantidad en condiciones de calentamiento y agitación, operación que precisa de balanza y placa calefactora con agitación. Una vez elaborado, se dosifica en tubos o matraces (según precise el análisis), los cuales taparemos con un algodón, colocaremos en una o varias bolsas autoclavables y esterilizaremos. Una vez esterilizados procederemos de dos formas distintas según la finalidad del mismo: Dosificación en Placas de Petri y posterior almacenamiento en frigorífico, si no van a ser utilizadas inmediatamente. O bien, enfriamiento en baño de agua a unos 40ºC para una posterior siembra en masa.

4 Obtención de un banco de diluciones Método que consiste en preparar diluciones de una muestra de alimento para que el recuento o aislamiento de colonias posterior a la siembra, resulte eficaz. Material Alimento Bolsa de stomacher Stomacher Tubos de ensayo Agitador de tubos Mechero Pipetas estériles y pipeteador Caldo de triptona o agua destilada estéril Técnica 1.- Tomar 10 g del alimento. Pasarlo junto a 90 ml de caldo de triptona (solución isotónica) o agua destilada en una bolsa de stomacher. Homogeneizar el conjunto en el Stomacher. El resultado es una dilución 1: Tomar 1 ml. de la dilución 1:10 y pasarlo a un tubo al que previamente se le ha añadido 9 ml. de caldo o agua destilada. Homogeneizar la solución en un agitador de tubos. La dilución que hay ahora en este tubo es 1: De manera análoga podríamos conseguir las diluciones 1:1.000; 1:10.000; 1: etc Nota: Todos los tubos se marcarán con rotulador según la dilución que posean.

5 Siembra en masa Técnica de siembra fundamental para la obtención de los recuentos microbianos característicos de las principales técnicas clásicas de análisis microbiológicos. Material Banco de diluciones de un alimento Pipetas y pipeteador Placas de Petri Matraces con agar fundido en baño maría Técnica Tomar 1 ml de una solución y vertirlo en una placa Petri vacía. Vertir en la misma placa unos 15 ml del agar fundido. Mezclar el conjunto con suave agitación y dejar solidificar. Las placas así sembradas ya están listas para su incubación en estufa. Para evitar condensaciones de agua sobre la superficie del agar que puedan dispersar las colonias superficiales y falsear el recuento, se suele ubicar las placas en la estufa, de forma invertida.

6 RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESÓFILOS El análisis microbiológico objeto de la práctica permitirá estimar la flora total que porta el alimento, la cual reflejará su calidad higiénico-sanitaria. Material Pipetas estériles de 1 ml y pipeteador Placas Petri Banco de diluciones del alimento. Baño María Mechero Medio de cultivo Técnica agar Plate Count (PCA) - Enfriar los matraces que contienen el medio de cultivo recién esterilizado (PCA), en un baño María y esperar que la temperatura descienda hasta unos 35ºC. - Preparar un banco de diluciones del alimento problema y realizar una siembra en masa por duplicado de cada una de las diluciones. - Homogeneizar, dejar solidificar el agar, invertir las placas e incubar a 30ºC durante horas. - Transcurrido este tiempo, elegir una dilución (asociada a un crecimiento de un número de colonias comprendido entre 30 y 300 aproximadamente) y realizar el recuento. Multiplicando este valor por el factor de dilución obtendremos el resultado.

7 RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS TOTALES El análisis microbiológico de las Enterobacterias permitirá predecir el grado de contaminación fecal que tiene un alimento. Para su análisis se utilizará la técnica de recuento en medio sólido. Material Pipetas estériles de 1 ml y pipeteador Placas Petri estériles Estufa de cultivo Medio de cultivo Técnica Agar-Cristal Violeta-Rojo Neutro-Bilis-Glucosa (VRBG - Oxoid) - Enfriar los matraces que contienen el medio de cultivo recién esterilizado (VRBG) en un baño María y esperar que la temperatura descienda hasta unos 40ºC. - Preparar un banco de diluciones del alimento problema. - Realizar una siembra en masa por duplicado de las diluciones preparadas, mezclando en placas Petri, 1 ml de cada una de las diluciones decimales con, aproximadamente, 15 ml del medio VRBG fundido. - Una vez que ha solidificado el medio, se recubre con una nueva capa de agar. - Dejar solidificar el agar, invertir las placas e incubar a 37ºC durante horas. - Una vez transcurrido este tiempo se cuentan las colonias violeta rodeadas de un precipitado rojo-violeta.

8 RECUENTO DE COLIFORMES El grupo formado por las denominadas coliformes comprende aquellas Enterobacterias capaces de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas. Niveles de coliformes altos en un alimento indican manipulación y elaboración deficientes. Para alimentos no procesados o con tratamiento insuficiente, es preferible el análisis del grado de contaminación fecal mediante la evaluación de los niveles de coliformes fecales que mediante el análisis de Enterobacteriaceas totales. Su análisis se realizará utilizando medio líquido. Material Banco de diluciones del alimento problema (1:10, 1:100 y 1:1000). Tubos de ensayo con 10 ml de Caldo lactosa bilis verde brillante. Tabla NMP Campana Durham Estufa incubadora Placas de Petri Pipetas estériles de 1 ml y pipeteador Medio de cultivo líquido Técnica Caldo lactosa bilis verde brillante - Inocular las tres series de 3 tubos con 1ml de cada dilución respectivamente. Cada tubo irá provisto de una campana Durham para la recogida de gases. - Incubar todos los tubos a 37 ºC durante horas. Observar los tubos y tomar nota de los que tengan desprendimiento de gases. - Con ayuda de la tabla NMP (3 SERIES DE 3 TUBOS) calcular el número de coliformes por gramo o ml de alimento.

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10 RECUENTO DE ESTREPTOCOCOS FECALES Los estreptococos son considerados indicadores de la contaminación fecal de agua y alimentos. Por ser muy resistentes a condiciones de congelación o desecación se consideran buenos indicadores para valorar, las condiciones higiénicas y de conservación de alimentos congelados o desecados. Para su determinación se utilizarán caldos de cultivo líquidos. Material. Serie de diluciones seriadas del alimento problema (1:10, 1:100 y 1:1000). Tubos de ensayo con caldo K.A.A Tablas NMP. Técnica Prueba presuntiva. - Inocular las tres series de 3 tubos con 1ml de cada dilución respectivamente. - Incubar a 37ºC durante 24 horas. - Con ayuda de las tablas NMP (3 SERIES DE 3 TUBOS) calcular el número de estreptococos por gramo o ml de alimento (los tubos que presenten ennegrecimiento se considerarán como positivos)

11 METODOS RAPIDOS PARA LA IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS. TIRAS API-20E. El sistema API-20E para enterobacterias es una tira con 20 cápsulas que permite buscar 22 caracteres bioquímicos para identificar enterobacterias al cabo de horas. Material Kit API-20E Enterobacterias Pipetas Pasteur Aceite de parafina esteril Tubos con 5 ml. de agua estéril Solución co el microorganismo problema Técnica - Hacer una suspensión en 5 ml de agua estéril a partir de una sola colonia, previamente separada en medio de aislamiento. - Repartir aproximadamente 5 ml de agua en los alvéolos de la cámara de incubación para dar el grado de humedad necesario. - Sacar una tira API-20E y colocarla sobre la mencionada cámara. - Añadir la suspensión bacteriana con pipeta Pasteur, con la punta apoyada sobre lado de cada cúpula y evitando que se formen burbujas de aire. - Para los caracteres CIT, VP y GEL, llenar tubo y cúpula. Para los caracteres restantes llenar solo el tubo. - En los caracteres ADH, LDC, ODC URE y H 2 S, llenar las cúpulas con aceite de parafina estéril, con el fin de obtener condiciones de anaerobiosis. - Cerrar la cámara con la tapa, e incubar a 35-37ºC durante18-24 h.

12 - Tras la incubación, realizar la lectura de las galerías, apuntando los resultados en la hoja de resultados. - Si la Glucosa es positiva y/o 3 o más test son positivos, efectuar el revelado de los test que requieren reactivos (TDA, IND, VP, NITRATOS y NITRITOS). - El código obtenido en la hoja de resultados, nos servirá para identificar el microorganismo correspondiente a la cepa analizada.

13 TINCIONES 1.- Material Portaobjetos Asa Pinzas portaobjetos Suspensión de microorganismos Mechero Microscopio 2.- Productos Violeta de Genciana Fuchsina básica o Safranina Azul de metileno Reactivo de Lugol Verde de malaquita Alcohol de 96º Aceite de inmersión a).- Tinción Simple 1. EXTENSIÓN: Depositar con un asa de siembra una gota del material a examinar en el centro de un portaobjetos limpio. Extender suavemente hasta ocupar una superficie de 1 cm 2 aproximadamente. Si se trata de observar un microorganismo que está en un medio de cultivo sólido, se pone previamente una gota de agua destilada en el centro del portaobjetos y a continuación se toca ligeramente la colonia y se hace la extensión. 2. SECADO: Dejar secar la preparación al aire o con calor suave. 3. FIJACIÓN: Para ello, se toma el portaobjetos con las pinzas y se pasa 3-4 veces por la llama del mechero hasta que todo el agua quede evaporada. 4. APLICACIÓN DE COLORANTES: Una vez fría la preparación, se cubre con la solución del colorante y se deja actuar durante un cierto tiempo, según su naturaleza. Así, para Violeta de Genciana basta un minuto, para la Fuchsina básica diluida, 2-3 minutos; para el azul de metileno 3-5 minutos. 5. LAVADO: Lavar con agua destilada para arrastrar el exceso de colorante. 6. SECADO FINAL: Secar la preparación al aire o con calor suave. 7. Observar al microscopio con objetivo de inmersión.

14 b).- Tinción de Gram 1. Extensión. 2. Desecación. 3. Fijación. 4. Teñir con Violeta de Genciana durante un minuto. 5. Añadir el reactivo de Lugol, y dejarlo actuar durante un minuto. 6. Lavar con agua. 7. Decolorar con alcohol hasta que salga exento de colorantes. Generalmente bastan unos 30 segundos. 8. Lavar con agua. 9. Añadir Fuchsina básica, y dejarla actuar 1-2 minutos. 10. Lavar, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión. * Los microorganismos Gram Positivos aparecen de color violeta, mientras que los Gram Negativos se observan de color rojo o rosa.

15 BIBLIOGRAFIA MARTIALAY VALLE, F. (MINISTERIO DE DEFENSA)(1988). Prontuario de técnicas en microbiología de alimentos. Pd de Defensa. PASCUAL ANDERSON, M.R. (1992). Microbiología Alimentaria. Metodología Analítica para alimentos y bebidas. Ed. Diaz de Santos. Madrid. ICMSF (1991). Microorganismos de los alimentos. Técnicas de analisis microbiológico. Ed. Acribia. Zaragoza. HERNANDEZ JIMENEZ Y OTROS (1994) Análisis microbiológicos de alimentos y control de los procesos de fabricación. Instituto de Agroquímica y Tecnología de los alimentos de la UPV.