NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Transcripción

1 NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO El acceso al laboratorio de prácticas sólo se permite a los alumnos que estén realizando las prácticas. No se admiten visitas por razones de seguridad. Los laboratorios de investigación son de acceso restringido al personal del Departamento. Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se esté trabajando en el laboratorio. Durante el periodo de prácticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio. Debe respetarse la prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningún objeto (bolígrafos...) o tocarse los ojos y nariz. En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa u objetos personales. Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, así como de los microscopios que haya usado. Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobará que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio. Está prohibido pipetear con la boca. Ante un vertido accidental de material microbiológico debe informarse inmediatamente al profesor encargado del grupo. No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener protegidas las manos. No se manejarán los autoclaves o el material recién esterilizado si no se dispone de guantes apropiados. La eliminación de residuos, material desechable y material reciclable se realizará siguiendo las pautas de la práctica 1, utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto. Se deben lavar las manos con jabón antiséptico ante cualquier sospecha de contaminación y siempre antes de marcharse del laboratorio.

2 EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA Para trabajar en un laboratorio de Microbiología se requieren unas técnicas específicas y diferentes de las que se utilizan en otras disciplinas. Es imprescindible trabajar en condiciones asépticas: El material e instrumental que se va a utilizar, así como los medios de cultivo, deben ser sometidos a algún procedimiento de esterilización, eliminándose de ellos cualquier posible microorganismo. Para mantener las condiciones de esterilidad, debemos trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un mechero Bunsen. En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele realizarse utilizando cultivos axénicos o puros, es decir, que contienen organismos de una sola especie microbiana. La posibilidad de contaminación está siempre presente porque los microorganismos se encuentran en todos los ambientes: En el aire, en el agua, en nuestra piel y, en general, en todo lo que tocamos. Para evitar las contaminaciones hemos de observar las siguientes normas: El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estériles. Los tubos o matraces deben ser tapados con algodón hidrófobo estéril o cubiertos con un capuchón metálico, para impedir la entrada de microorganismos. Si se usan placas de Petri deben mantenerse tapadas mientras no se estén manipulando. Los instrumentos que van a entrar en contacto con el medio de cultivo, con los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa de siembra, pipetas, etc) deben ser previamente esterilizados. Materiales Empleados y Forma de Uso Asa e hilo de siembra: Antes de su utilización, se esterilizan sometiéndolos a la acción de la llama de un mechero hasta que el filamento quede incandescente. Luego se flameará la parte inferior del filamento. Una vez utilizados, deben flamearse de nuevo con el objeto de eliminar los microorganismos que quedan en ellos. Pipetas Pasteur: Son generalmente de vidrio y se utilizan para la transferencia de cultivos líquidos, diluciones de suero, etc con ayuda de un chupete de goma u otro sistema de aspiración mecánica. Pueden utilizarse, con el extremo inferior cerrado, en sustitución del hilo de siembra, cuando se realizan siembras en el interior del agar (en profundidad). Para ello se sella previamente el extremo de la misma con la llama del mechero.

3 Varillas de vidrio macizo acodadas (cayados): Sirven para distribuir los microorganismos de la muestra sobre la superficie del medio de cultivo contenido en una placa de Petri. Se utilizarán previamente esterilizadas, impregnándolas en alcohol y pasándolas posteriormente por la llama del mechero. También, pueden hacerse usando una pipeta Pasteur, sellando el extremo de la misma y acodándola con la llama del mechero. Pipetas graduadas de vidrio o plástico: Se suministran ya estériles a los alumnos, dentro de estuches metálicos o bien empaquetadas de forma individual (envueltas en papel satinado o plástico para mantener su esterilidad), en cualquier caso deben abrirse cerca de la llama del mechero. La pipeta, si es de cristal, y por lo tanto reciclada, debe flamearse ligeramente antes de ser usada. Las pipetas llevan un algodón en la boquilla, que actúa como filtro, para evitar la contaminación y para impedir la llegada de líquido al sistema de succión. Dicho algodón debe permanecer en la boquilla durante el uso. Bajo ningún concepto se debe pipetear con la boca una muestra microbiológica. Para pipetear suspensiones de microorganismos se utilizan chupetes o pipeteadores más o menos sofisticados, como son las peras de goma provistas de válvulas que permiten controlar la succión y el dispensado de los líquidos o los dispositivos semejantes a jeringas en los que se coloca la pipeta y que operan por medio de un émbolo o con ayuda de bombas eléctricas. Tubos de ensayo con cultivos problema y placas Petri: Se destapan cerca de la llama del mechero utilizando para ello sólo los dedos que quedan libres en la mano que sostiene el asa de siembra. Se flamea la boca del tubo, se toma una pequeña muestra del cultivo con asa de siembra estéril, previamente atemperada, y tras flamear de nuevo la boca del tubo colocamos el tapón. Todo el proceso se

4 realiza cerca de la llama. Si el medio es líquido, se debe agitar el tubo antes de tomar la muestra, porque los microorganismos tienden a sedimentar. En el caso de que el medio sea sólido (tubos de agar inclinado y placas Petri), la muestra se obtendrá rozando ligeramente con el asa la zona en la que se aprecia masa microbiana. Los tubos y las placas deben permanecer abiertos el menor tiempo posible con el fin de evitar contaminaciones. Medios de cultivo: Pueden ser líquidos, sólidos y semisólidos. Se distribuyen en matraces, tubos de ensayo y placas de Petri. Estas últimas sólo llevan medio sólido. Su preparación y esterilización se describe más adelante. La composición de los medios, colorantes y reactivos utilizados en prácticas se describe en el anexo del final de la guía. Figura III. Manejo del asa de siembra durante una inoculación.

5 ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO En Microbiología es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del material. Asimismo, es muy importante la recuperación del material reciclable y la eliminación del material desechable. Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes adecuados, provistos de tapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipetas, se separa del resto del material recogiéndose en un contenedor vertical u horizontal lleno de una solución desinfectante, como por ejemplo una solución diluida de hipoclorito, en la que permanecerá antes de su lavado durante 24 horas. Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia orgánica (procedente de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes físicos o químicos utilizados en la descontaminación de los mismos, no puede asegurarse la total destrucción de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por ello, se recomienda utilizar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos más largos de tratamiento que para la desinfección o la esterilización de material limpio. Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminación de instrumentos, equipos y material que sean estables al calor, así como de material desechable. A tal objeto se coloca este material en recipientes adecuados y se introducen en el autoclave sometiéndolos a la acción del vapor de agua a una atmósfera de sobrepresión (121º C) en ciclos más prolongados de lo habitual (1 hora en lugar de 30 minutos). Una vez efectuado este tratamiento, se procede a su lavado para eliminar toda materia extraña, sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o utilizando detergentes, mezcla crómica o cualquier otro procedimiento enérgico, tanto mecánico como químico. Se aclara bien con abundante agua y se deja escurrir y secar a temperatura ambiente. En el caso de las pipetas, y antes de ser lavadas, debe extraerse con ayuda de un alambre o pinzas especiales, el trozo de algodón que tienen en la boquilla. Algunos de los objetos sucios y contaminados (portaobjetos, pipetas, etc), después de lavados.

6 PRÁCTICA 1 PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL MATERIAL Objetivos Conocer la importancia de la esterilización y familiarizarse con el manejo de los procedimientos más frecuentemente utilizados para llevarla a cabo. Prelaboratorio Diferencie el concepto de esterilización y asepsia. Cuáles son las clases de esterilización de calor seco y calor húmedo. Enuncie y defina otras formas de esterilización. Describa métodos que permitan comprobar la eficacia de los métodos de esterilización. Marco Teórico En Microbiología se define esterilización como la destrucción o eliminación total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material, incluida las endosporas bacterianas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad. El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado: El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc, se cierran con algodón graso o tapones metálicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Además, cuando se usa algodón, ha de cubrirse éste con un papel impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les coloca en la boquilla un trocito de algodón que actuará como filtro, evitando la contaminación del operario con los microorganismos de la muestra y que éste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metálicas, o bien se envuelven individualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur. El material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para su uso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se esterilizan con óxido de etileno o radiaciones. Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave. Existen varios métodos para llevar a cabo el proceso de esterilización y la elección de uno determinado viene condicionado por el tipo de material que se quiere esterilizar.

7 PRÁCTICA 2 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO UNIVERSIDAD POPULAR DEL CESAR Objetivos Aprender a preparar, esterilizar y almacenar distintos tipos de medios de cultivo. Pre Laboratorio Defina que es un medio de cultivo. Tipos de medio de cultivo según: Estado Físico Composición Utilización Introducción Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, preparados en el laboratorio, que suministran los compuestos necesarios para el desarrollo de los microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer satisfactoriamente en casi cualquier medio de cultivo, otras bacterias necesitan medios especiales y existen algunas que no pueden crecer en ninguno de los medios desarrollados hasta ahora. Los distintos tipos de medios de cultivo varían según las necesidades de los microorganismos objeto de estudio, pero todos han de cumplir los siguientes requisitos: Han de contener las sustancias necesarias para el crecimiento del microorganismo que se siembra. Han de mantenerse estériles hasta el momento de la siembra. Los requerimientos para el crecimiento microbiano se pueden agrupar en dos categorías: Físicos y químicos. Entre los primeros se incluyen la temperatura, el ph y la presión osmótica; entre los requerimientos químicos se encuentran el agua, las fuentes de carbono y nitrógeno, las sustancias minerales, el oxígeno y determinados factores orgánicos de crecimiento. Finalmente, una vez sembrados, deben ser incubados a la temperatura y condiciones adecuadas. Preparación de los medios de cultivo La preparación de medios de cultivo se ha simplificado en gran medida por la comercialización de medios deshidratados, en los que los diferentes nutrientes se encuentran ya mezclados en las debidas proporciones, siendo sólo necesario la adición de la cantidad correcta de agua destilada para disolver sus componentes. Cuando se prepara un medio líquido se debe disolver totalmente todos sus componentes en agua destilada. A continuación el caldo se envasa en los

8 recipientes adecuados (matraces o tubos), tapando los mismos y esterilizándolos. La preparación de un medio sólido puede hacerse de dos maneras: Preparar el caldo y añadir agar al 1,5% o bien utilizar un medio sólido comercial. Independientemente de la forma elegida para hacerlo, la preparación de los medios de cultivo sólidos requiere procedimientos especiales, ya que el agar es insoluble en agua. Por ello, una vez añadida el agua, se debe calentar la mezcla hasta 100ºC, para permitir que el agar se funda y quede incorporado al resto de los nutrientes disueltos. El medio fundido se dispensa en tubos o matraces, que se tapan y se esterilizan. Los medios sólidos contenidos en tubos pueden dejarse enfriar en posición vertical, si van a ser inoculados en profundidad, o bien pueden inclinarse para que al solidificarse en esa posición adopte la forma inclinada que proporciona una mayor superficie de siembra. Si se desean preparar placas de Petri, se utilizará el medio de cultivo que ha sido esterilizado en un matraz y, una vez atemperado, se verterá en placas vacías en un ambiente aséptico, como el que proporciona la proximidad de la llama de un mechero o una campana de flujo laminar. En algunas ocasiones, el medio de cultivo destinado a placas puede conservarse estéril en tubos, que se fundirán al baño María cuando se vayan a preparar las placas. Si se han de incorporar al medio compuestos termolábiles, como vitaminas o antibióticos, se esterilizarán éstos por filtración y se añadirán al medio de cultivo previamente esterilizado en autoclave y una vez que este se haya atemperado. En todos los casos se han de seguir las instrucciones del fabricante. La conservación de los medios ya preparados puede hacerse a temperatura ambiente, pero es preferible conservarlos a 4ºC para retrasar su deshidratación.