Fisiología Bacteriana. Tarea de aula I Técnicas básicas de Microbiología Control microbiológico Siembra y aislamiento

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Ernesto César Sáez Córdoba
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1 Fisiología Bacteriana Tarea de aula I Técnicas básicas de Microbiología Control microbiológico Siembra y aislamiento

2 Objetivo de la Microbiología: Identificación y caracterización de microorganismos Técnicas básicas de laboratorio de microbiología

3 Técnicas básicas de laboratorio de microbiología Control microbiológico mediante desinfección y esterilización. Manejo de técnicas asépticas.

4 Desinfección y esterilización - Métodos Esterilización: Eliminación total de cualquier forma viviente en un medio o material de trabajo con un agente físico o químico. El material permanece estéril si se encuentra en un compartimento aislado, libre del contacto con microorganismos del ambiente exterior. Desinfección: Destrucción de patógenos vegetativas pero no endosporas bacterianas. Antisépcia: Uso de agentes químicos sobre superficie del cuerpo para destruir patógenos vegetativos

5 Equipos para Esterilización Por Calor. Húmedo Autoclave, H 2 O hirviendo. Seco Horno, mechero Bunsen Por Radiación. Ionizantes: (Mat. farmacéutico, quirúrgico). No ionizantes (UV) (Zonas aéreas, sup. de trabajo) Por Filtración. Filtros de distinto material y tamaño de poro (membranas de 0.45 y 0.22 μm). (Líquidos termosensibles, gases) Válvula de Seguridad Válvula de Drenaje Tapa Calderin Bandeja Resistencia Por Compuestos químicos. Gaseosa Oxido de etileno, Formaldehido o H2O2 (Material plástico o sensible al calor). Detergentes, comp. fenólicos, alcoholes, ácidos y bases, Me pesados, agentes oxidantes, colorantes, agentes alquilantes: Desinfectantes y antisépticos. A- Filtro de celulosa de 0.22 micras de diámetro de poro. B- Depósito para la muestra o medio. C- Depósito para la muestra o medio filtrado. D- Sistema de vacío.

6 Condiciones de inactivación total por calor húmedo: - Tiempo térmico mortal - Tiempo de reducción decimal - Punto térmico mortal Microorganismo La mayoría de células vegetativas, de bacterias, levaduras y hongos Bacilo tuberculoso Bacilo tuberculoso Bacilo tuberculoso Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis La mayoría de esporas de bacterias patógenas Esporas del patógeno Clostridium botulinum Esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos Esporas de Clostridium y Bacillus saprofitos Condiciones 80 o C, 5-10 min 58 o C, 30 min 59 o C, 20 min 65 o C, 2 min 60 o C, 60 min 100 o C, pocos min 100 o C, 5,5 horas 100 o C, muchas horas 120 o C, 15 minutos

7 Causas de la Esterilización - Desnaturalización de proteínas - Fusión de lípidos de membrana - Ruptura de enlaces débiles (ptes. H entre grupos C=O y H 2 -N) Ocurre más fácilmente por calor húmedo (en atmósfera saturada de vapor de agua), debido a que las moléculas de agua pueden desplazar a los ptes. H. Calor húmedo: La inactivación por calor húmedo requiere menores temperaturas que la inactivación que se realiza en ausencia de agua.

8 Calor húmedo - Autoclave Protocolo de esterilización en Autoclave Temperatura: C Presión: 1 atmósfera sobre la atmosférica Tiempo: min Válvula de Seguridad Tapa Recomendaciones El tiempo depende de la cantidad y tamaño de los materiales a esterilizar. No colocar recipientes completamente cerrados en la autoclave. El vapor debe entrar en contacto con todo lo que se quiere esterilizar. No esterilizar solventes o químicos corrosivos. Si se esterilizan líquidos, bajar la presión lentamente y dejar enfriar los recipientes dentro de la autoclave. Válvula de Drenaje Calderin Bandeja Resistencia

9 Calor seco - Protocolo de esterilización en Horno Temperatura: C Tiempo: 2-3 hs - Inceniración a la llama

10 Control de la temperatura y el tiempo del tratamiento térmico: - Inactivación parcial Pasteurización (alimentos) de la población microbiana - Inactivación total Esterilización en autoclave

11 Autoclave: Permite calentar muestras por calor húmedo a temperaturas superiores a las de ebullición del agua (sin que ésta hierva). El tratamiento se efectúa en un compartimento estanco saturado con vapor de agua y a presiones superiores a la atmosférica. Parámetros de esterilización: temperatura 121 C y min. Diagrama del Autoclave Válvula de Seguridad Tapa Calderin Control de esterilización: esporas de especies saprofitas, que son las formas de vida que más resisten el calor sin perder viabilidad. Bandeja Resistencia Válvula de Drenaje

12 Agentes Químicos Agentes Esterilizantes Agentes Desinfectantes (químicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patógenos (infecciosos) de un material. Efectos tóxicos sobre tejidos vivos (sólo sobre materiales inertes) Agentes Antisépticos Sust químicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefacción de materiales vivos. Baja actividad tóxica hacia los tejidos vivos donde se aplican. Quimioterápicos o quimioterapéuticos Efecto de Desinfectantes y Antisépticos: Concentración del agente Tiempo de exposición ph Naturaleza del microorganismo Presencia de materiales extraños

13 Efecto de los Agentes Agentes que Dañan la Membrana Detergentes Compuestos Fenólicos Alcoholes Agentes Desnaturalizantes de Proteínas Ácidos y Bases Fuertes Ácidos Orgánicos Agentes Modificadores de Grupos Funcionales Metales Pesados Agentes Oxidantes Colorantes Agentes Alquilantes

14 Técnicas asépticas Manipulación del material en condiciones de esterilidad

15 Manipulación del material en condiciones de esterilidad

16 Manipulación del material en condiciones de esterilidad

17 Preparación de medios de cultivo en placa - Volcar el medio en condiciones de asepsia (20-30 ml/placa) y esperar a que solidifique (ver figura). Luego secar las placas invertidas en estufa a 42ºC. Llenado del medio Mesada Tapa Rotulo Medio de cultivo

18 Inoculación

19 Inoculación de un medio de cultivo semisólido por punción con hilo de siembra

20 Esterilización de la espátula de Drigalsky Dejar enfriar al lado de mechero y Extender sobre la superficie la siembra Etanol

21 Diluciones seriadas y recuento de bacterias (UFC) Espátula de Drigalsky

22 Depósito y posterior quemado Técnica de aislamiento de colonias

23 Incubación en función del requerimiento de oxígeno Incubador con agitación Incubador sin agitación

24 Trabajo Práctico N 1: Técnicas básicas de Microbiología. Esterilización de materiales. Manejo de técnicas asépticas. - Preparación de medios de cultivo - Esterilización en autoclave - Acción antimicrobiana de la radiación UV - Acción de antisépticos y desinfectantes - Manejo del material en condiciones asépticas - Siembra y aislamiento Trabajo Práctico N 2: Técnicas básicas de Microbiología. Aislamiento de microorganismos de la naturaleza - Aislamiento de microorganismos del suelo, agua, ricota - Medios de cultivo selectivos y diferenciales - Medios de enrriquecimiento

25 Trabajos Prácticos TP 1: Esterilización y técnicas asépticas TP2: Aisalmiento de microorganismos, Medios diferenciales y selectivos TP3: Observaciones macro- y microscopicas. Tinción TP4: Caracteristicas metabólicas. Medios especiales. TP5: Aplicaciones biotecnológicas. TP6: Creciemiento bacteriano y antibióticos TP7: Vida comunitaria y columna de Winogradsky

26 TP N 1: Armado de la Columna de Winogradsky Objetivos del trabajo: Los alumnos deberán: Armar una columna de Winogradsky. (se realiza el segundo día del TP1). Observar y describir la sucesión temporal de microorganismos en la columna Tomar muestras a distintos niveles de la columna para identificar la composición microbiana (grupos de microorganismos). A distintos tiempos, retirar y preparar los portaobjetos sumergidos para observar los distintos microorganismos adheridos a su superficie. Interpretar desde un punto de vista ecológico las interacciones existentes en el nicho que es objeto del estudio. A) Materiales: 2 Tubos de vidrio de aproximadamente 50 cm. de longitud. (botellas plásticas de agua mineral o soda de 1.5 lts). Fuente de luz incandescente. ( 60W). Drogas: SO 4 Ca -, CO 3 Ca -, PO 4 HK 2 (Se puede utilizar huevo duro y tiza). Papel de filtro o residuos vegetales. Fango proveniente de pantano, zanja o río como fuente de inóculo. (Se aconseja una zona del río con aguas estancadas)

27 Normas de Bioseguridad 1) No se puede comer, beber, fumar ni maquillarse en el laboratorio, ni llevarse a la boca ningún elemento que haya sido utilizado en el laboratorio (biromes, marcadores, dedos, etc.) 2) Es obligatorio asistir al laboratorio con guardapolvo de mangas largas y con puño. Las personas de pelo largo deben concurrir con el mismo atado y/o recogido. 3) Si un cultivo es volcado, informar inmediatamente al docente con el que se procederá a limpiar la zona con una solución bactericida. 4) El material contaminado (tips, pipetas, tubos), se descartará en envases provistos a tal efecto. 5) No volcar los cultivos en las piletas. 6) Una vez finalizada la clase lavarse las manos cuidadosamente con agua y jabón y con algún desinfectante (lo mismo durante la clase si accidentalmente se tocó algún cultivo).

28 CONDICIONES DE REGULARIDAD DE LA MATERIA 1) Aprobación del parcial teórico/prácticos. Aprobación de los trabajos prácticos: 80% de asistencia. 80% de parcialitos aprobados. Se tomará uno por cada trabajo práctico y al comienzo del mismo. Evaluación favorable de los informes que deberán realizar y entregar al finalizar cada trabajo práctico.

29 Traer los siguientes materiales para los prácticos Por comisión: Agua oxigenada (10 vol) Alcohol 96º, cuatro botellas Rollos de papel absorbente de cocina 4 paquetes Hisopos (vástago largo de madera) un paquete Papel borrador o de diario Bolsitas chicas para descarte Dos latas grandes de conservas vacías con tapa de metal 2 botellas de plástico transparente de litros iguales Barro y agua estancada. 1 kg de barro y 2 litros de agua Por persona: Marcador indeleble Encendedor Guardapolvo Cinta de papel

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