LABORATORIO 8. REINO MÓNERA OBSERVACIÓN DE BACTERIAS COLORACIÓN DE GRAM

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Eugenia Sevilla Piñeiro
hace 6 años
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1 LABORATORIO 8. REINO MÓNERA OBSERVACIÓN DE BACTERIAS COLORACIÓN DE GRAM Profesor: Luis Francisco Moreno B. Biólogo, M. Sc. Biología. El reino mónera es el grupo de microorganismos más pequeño que se puede ver al microscopio compuesto. A este reino pertenecen las bacterias, que se caracterizan porque no tienen núcleo, su pared es de carbohidratos, se reproducen asexualmente y resisten a las condiciones ambientales adversas mediante esporulación, entre otras características. Las bacterias no tienen color, por lo que se requiere teñirlas para hacerlas visibles. Los procedimientos de coloración que ponen de manifiesto diferencias entre las células bacterianas o partes de una célula bacteriana, se conocen como técnicas de coloración diferenciales. Son algo más elaboradas que la técnica simple en la que las células se someten a una sola solución (o reactivo) colorante. El bacteriólogo danés, Christian Gram, descubrió en un método de coloración con cristal violeta, el cual resulto dividiendo a las bacterias en dos grupos: El de las Gram positivas que retienen dicho colorante y el de las Gram negativas, que no lo retienen, cuando se exponen a decoloración con alcohol cetona. Después de la decoloración, se utiliza safranina, que es colorante de contraste de color rojo, el cual imparte un color rosado a los organismos decolorados, y no altera el color de los que retuvieron el colorante violeta. También se puede utilizar otros colorantes de contraste. La razón por la cual las bacterias Gram positivas no se decoloran con el alcohol cetona se debe a que se utiliza un mordiente inmediatamente después de la aplicación del cristal violeta. Dicho mordiente en la forma de una solución yodada, reacciona con el cristal violeta y el magnesio (Mg), dentro de la célula, para formar un complejo cristal violeta yodo (C.V.I.) que resiste la decoloración. Las explicaciones más plausibles de este fenómeno son las que se refieren a la estructura y composición de la pared celular. Las bacterias Gram negativas, contienen un porcentaje más alto de lípidos que las bacterias Gram positivas. Las paredes celulares de las bacterias Gram negativas son también más delgadas que las de las Gram positivas. Hay pruebas experimentales en el sentido de que el tratamiento con alcohol extrae lípidos con lo cual se aumenta la porosidad o permeabilidad de la pared celular Gram negativa. Así el complejo cristal violeta-yodo (CV-1) puede extraerse en los organismos Gram negativos y de esta manera se destiñen. Las paredes celulares de las bacterias Gram positivas, por su composición diferente (bajo contenido lípido) se deshidratan durante el tratamiento con alcohol, los poros se disminuyen afectando la permeabilidad y no se logra extraer el complejo (CV-1). Además las bacterias Gram positivas hacen magnesio en su ARN, y las Gram positivas no.

2 Todo esto señala que la pared celular de las bacterias Gram positivas es el sitio de retención del colorante primario. En las bacterias Gram negativas esta reacción no ocurre, con el resultado de que el cristal violeta es removido. Pese a la antigüedad del método de coloración diferencial, constituye aún hoy día una de las técnicas más importantes en el trabajo bacteriológico. Las Gram positivas son, por lo general, más susceptibles a la penicilina, a los detergentes tenso activos y a ciertos colorantes. Las bacterias Gram negativas constituyen un grupo más susceptible a otros antibióticos como la estreptomicina. Normalmente, la técnica de coloración de Gram, requiere varios intentos antes de llegar a ser completamente dominada y aprendida. 2. OBJETIVOS 2.1 Conocer y aplicar la técnica de coloración de Gram a bacterias cultivadas. 2.2 Diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas. 2.3 Determinar las bacterias observadas, con base en su morfología y organización. 3. MATERIALES 3.1 Guía de laboratorio. 3.2 Microscopio compuesto. 3.3 Portaobjetos. 3.4 Cubreobjetos. 3.5 Jabón. 3.6 Papel cocina. 3.7 Papel de arroz. 3.8 Limpia lentes. 3.9 Reloj o cronometro X Muestra de bacterias X Gradilla X Agua destilada dispensador X Cristal violeta dispensador X Lugol con dispensador X Alcohol Cetona al 95% Safranina dispensador X Puente de coloración X Asa de nicromo o Henle X Mechero Candela o fósforos Aceite de inmersión X 3 4. MÉTODO Y RESULTADOS Reciba el tubo de ensayo con el cultivo de bacterias y deposítelo en la gradilla para que no se caiga, se rompa y contamine el laboratorio. Anote en la tabla 8.1 el nombre científico de la bacteria que le correspondió, el cual está anotado en el tubo de ensayo. Colocar un portaobjetos limpio sobre el puente de coloración. Prender el mechero y no colocarlo al borde del mesón, porque puede caerse y causar incendio o accidente. Colocarse tapa bocas. LUIS FRANCISCO MORENO. BIÓLOGO, M. SC. BIOLOGÍA 2

3 Tomar el asa de Henle con una mano. Con la otra destapar el tubo de ensayo que contiene las bacterias, muy cerca de la llama del mechero, para disminuir riesgos de fuga de bacterias al aire. Introducir el asa y raspar la parte superior del sustrato, donde están las bacterias. No introducir el asa dentro del sustrato, porque ahí no hay bacterias. Sacar el asa con la muestra de bacterias, sosteniéndola cerca de la llama, pero no tan cerca que queme la muestra. Tapar el tubo de ensayo. Fijar las bacterias al porta objetos que tiene en el puente, frotando la muestra y distribuyéndola uniformemente con el asa. Los siguientes pasos se resumen en una hoja que se coloca frente al puente de coloración. Cubrir la muestra con cristal violeta. Dejar actuar este colorante durante un minuto. Lavar el exceso de coloración con agua destilada. Cubrir el frotis con lugol durante un minuto. Cubrir el frotis con una solución de alcohol-cetona por 10 o 15 segundos. Este paso es crítico. Los frotis más gruesos requerirán más tiempo que los delgados Cubrir el frotis con safranina por un minuto Secar a la temperatura ambiente bandereando la muestra. Llevar al microscopio y no colocar cubreobjetos. Enfocar de aumento en aumento hasta 400. Dibujar, fotografiar e identificar partes y funciones. Fig. 8-1: Depositar una gota de aceite de inmersión sobre la muestra y enfocar en 1000X. El lente quedará inmerso en el aceite. Enfocar, dibujar, fotografiar e identificar. LUIS FRANCISCO MORENO. BIÓLOGO, M. SC. BIOLOGÍA 3

4 Fig. 8-2: Limpiar el lente con papel absorbente, para que eliminarle el aceite. Lavar el portaobjetos con agua y jabón. TABLA 8.1: Tipo de la bacteria utilizada. BACTERIA Nombre Científico COLOR PARED BACTERIA Violeta o rasada TIPO DE BACTERIA Gram + o Gram - FORMA BACTERIAL Coco, diplococo, estafilococo, bacilo IMPORTANCIA Enfermedad, utilidad, uso industrial, etc. OBSERVACIONES: 5. ANÁLISIS (Para consultar, reforzar y entender lo aprendido) Desarrollar el siguiente cuestionario y anexarlo a la presente guía. 5.1 Mencionar cinco características del Reino Mónera. 5.2 Mencionar cinco empresas agropecuarias que trabajen con bacterias. 5.3 Por qué las bacterias no son visibles al microscopio sino tiñéndolas? 5.4 Quién y en qué año se inventó la técnica de coloración de Gram? 5.5 Cuál es la importancia de la coloración de Gram? 5.6 En qué consiste la coloración de Gram? 5.7 Mencionar cinco características de las bacterias Gram positivas. 5.8 Mencionar cinco características de las bacterias Gram negativas. 5.9 Bajar e imprimir en un cuarto de página, una o más imágenes de la bacteria con la que trabajó en el laboratorio e identificar sus partes y funciones. LUIS FRANCISCO MORENO. BIÓLOGO, M. SC. BIOLOGÍA 4

5 5.10 Consultar y resumir en media página, las principales características de la bacteria con la que trabajó en el laboratorio Qué son bacterias Gram variables y cuál podría ser la característica de coloración de tales microorganismos? 5.12 Cuál es el reactivo al cual debe controlarse con mayor cuidado el tiempo, en la coloración de Gram y por qué? 5.13 Cuál es la utilidad de esta técnica en agropecuaria? En qué casos? 5.14 En qué consiste el uso biotecnológico de las bacterias? 5.15 En qué consiste la Ingeniería genética en relación con las bacterias? 6. CONCLUCIONES 6.1 Concluir sobre el grado de cumplimiento de los objetivos 6.2 Mencionar las aplicaciones del tema a la carrera que sigue, dando uno o más ejemplos concretos. 7. FUENTES DE CONSULTA Moreno, L. F. (productor) Video corto: Cómo ver las Bacterias? Técnica de coloración de Gram. Colombia. Recuperado de Canal: Biología Aplicada. Moreno, L. F. (productor) Video corto: Qué son las Bacterias y cuál es su utilidad e importancia? Colombia. Recuperado de Canal: Biología Aplicada. 8. FUENTES CONSULTADAS Autores y textos consultados para desarrollar la guía del laboratorio y profundizar sobre el tema. Apellido del autor, iniciales del nombre, año, título de la publicación, país, editorial. Orden alfabético. LUIS FRANCISCO MORENO. BIÓLOGO, M. SC. BIOLOGÍA 5

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