ANATOMIA PATOLOGICA Página 1 de 16. Instrucción técnica
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- Álvaro Márquez Blázquez
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1 PATOLOGICA Página 1 de 16 Modificaciones Revisión Fecha Descripción A 15/07/09 Primera edición Preparado Revisado Aprobado Nombre: Magdalena García Bonafé Cargo: Jefe de Servicio A. Patológica Fecha: 15/07/09 Firma: Nombre: Montserrat García Minguillán Cargo: Resp. Gestión de Procesos y U. de Calidad Fecha: 15/07/09 Firma: Nombre: Luis Alegre Latorre Cargo: Director Gerente Fecha: 15/07/09 Firma: El TEAP encargado de técnicas especiales mirará en el listado de microtomía las técnicas pendientes de realizar, comprobará si ya están los cristales preparados para ello y, si no
2 PATOLOGICA Página 2 de 16 procederá a cortarlas, para la realización de las técnicas, las cuales se realizarán con control positivo para evaluación de la técnica. Para ello hay que seguir una serie de normas:. En las técnicas argénticas no utilizar objetos metálicos para su realización.. Antes de empezar revisar si se tienen todos los reactivos en condiciones.. Leer y seguir detalladamente los protocolos.. Limpiar bien los alcoholes especialmente en el Rojo Congo. AZUL ALCIÁN FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10%. 2. Ácido acético 3% durante 3 minutos. 3. Solución de Azul Alcián durante 45 minutos en estufa a 60 º C. 4. Agua corriente en varios pases. 5. Hematoxilina de Harris durante 2 minutos. 6. Agua corriente en varios pases. 7. Deshidratar en alcoholes crecientes (70º, 96º y absoluto) durante 2 minutos. 8. Xilol durante 5 minutos. SOLUCIÓN ÁCIDO ACÉTICO 3% Ácido acético SOLUCIÓN AZUL ALCIÁN 97 ml 3 ml Azul alcián 1 gr 97 ml Ácido acético 3 ml Timol 1 cristal Disolver primero el azul alcián en agua destilada, una vez disuelto añadir el timol y esperar a su disolución. Filtrar la solución y posteriormente añadir el ácido acético. Mucina, células caliciformes y gramelos de mastocitos Núcleos Citoplasma azul oscuro rojo a rosado rosado pálido AZUL ALCIÁN - PAS FIJACION: Formalina neutra tamponada al 10%.
3 PATOLOGICA Página 3 de Teñir con la solución de Azul Alcián durante 30 minutos. 3. Lavar en agua corriente durante 5 minutos. 4. Oxidar en la solución de ácido periódico 0.5 % durante 10 minutos. 5. Lavar en agua corriente. 6. Colocar en el reactivo de Schiff durante 5 minutos. 7. Lavar con agua corriente tibia durante 10 minutos. 8. Deshidratar en alcoholes crecientes (70º, 96º y absoluto) durante 2 minutos. 9. Xilol durante 5 minutos. 10. Montar con DPX. SOLUCION ACIDO PERYÓDICO AL 0.5 % Ácido periódico REACTIVO DE SCHIFF 0.5 g Comercial Ácido hialurónico y mucina salivar Polisacáridos y muicinas neutras Azul Púrpura-rojo GROCOTT FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10 %. 2. Poner sobre el corte la solución A durante 20 minutos. 3. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 4. Poner sobre el corte la solución B durante 1 minuto. 5. Lavar en agua corriente. 6. Lavar en agua destilada dos veces durante 5 minutos. 7. Introducir en el contenedor 17 ml de agua destilada, 20 gotas del reactivo C, 10 gotas del reactivo D y 20 gotas del reactivo E. 8. Agitar bien la solución. 9. Colocar los cortes en el contenedor e incubar durante 50 minutos en estufa a 60 º C (ES FUNDAMENTAL QUE LA ESTUFA ESTÉ A 60 º C Y NO A MENOS). 10. Dejar enfriar durante 10 minutos. 11. Lavar dos veces en agua destilada durante 2 minutos. 12. Poner sobre el corte la solución F durante 3 minutos. 13. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 14. Poner sobre el corte la solución G durante 5 minutos. 15. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 16. Poner sobre el corte la solución H durante 30 segundos.
4 PATOLOGICA Página 4 de Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 18. Deshidratar en alcoholes crecientes (96º y absoluto) pasos rápidos para no perder el verde luz. 19. Xilol durante 5 minutos. 20. Montar con DPX. SOLUCIÓN A (comercial) SOLUCIÓN B (comercial) SOLUCIÓN C (comercial) SOLUCIÓN D (comercial) AOLUCIÓN E (comercial) SOLUCIÓN F (comercial) SOLUCIÓN G (comercial) SOLUCIÓN H (comercial) Hongos Mucina Fondo Negro Gris oscuro Verde TINCIÓN DE PERLS PARA EL HIERRO FIJACION: Formalina neutra tamponada al 10%. 2. Poner la SOLUCIÓN DE TRABAJO de ferrocianuro de potasio durante 30 minutos. 3. Lavar con agua destilada. 4. Contrastar con Carmín de Mayer o con Rojo Nuclear durante 5 minutos. 5. Lavar bien con agua corriente durante 2 minutos. 6. Deshidratar con alcoholes crecientes (96º y absoluto) durante 2 minutos. 7. Xilol durante 5 minutos. 8. Montar con DPX. SOLUCIÓN ÁCIDO CLORHÍDRICO 20 % Ácido clorhídrico SOLUCIÓN FERROCIANURO DE POTASIO 10% Ferrocianuro de potasio 20 ml 80 ml 10 gr
5 PATOLOGICA Página 5 de 16 SOLUCIÓN TRABAJO DE FERROCIANURO DE POTASIO Ácido clorhídrico 20 % 50ml Solución ferrocianuro de potasio 50 ml SOLUCIÓN CARMIN DE MAYER Ácido cármico Sulfato de aluminio y potasio Formol 40% 1 gr 10 gr 200 ml 1 ml SOLUCIÓN ROJO NUCLEAR Rojo nuclear 0.1 gr Solución sulfato aluminio 5% Llevar a hervor lentamente, enfriar y añadir 1 cristal de Timol. Hemosiderina, algunos óxidos y sales de hierro Núcleos y citoplasma azul rosa a rojo MOVAT FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10 %. 2. Poner el corte en solución de ácido peryódico durante 10 minutos. 3. Lavar en agua destilada en varios pases durante 10 minutos. 4. Poner los cortes en la SOLUCIÓN ARGÉNTICA DE TRABAJO en estufa a 60 º C durante 40 minutos. (ES FUNDAMENTAL QUE LA ESTUFA ESTÉ A 60 º C Y NO A MENOS). El corte debe tener un color tabaco. 5. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 6. Poner sobre el corte la solución de tiosulfato sódico durante 5 minutos. 7. Sin lavar, decantar el cristal y poner la solución de acetona durante 5 minutos. 8. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 9. Poner sobre el corte la solución de hematoxilina de Harris durante 5 minutos. 10. Lavar en agua corriente durante 2 minutos. 11. Decolorar con alcohol-ácido al 1 % durante 10 segundos. 12. Lavar en agua corriente durante 2 minutos. 13. Poner sobre el corte la solución de eosina durante 10 minutos. 14. Lavar en agua corriente durante 2 minutos. 15. Deshidratar en alcoholes crecientes (96º y absoluto) durante 2 minutos. 16. Xilol durante 5 minutos. 17. Montar con DPX.
6 PATOLOGICA Página 6 de 16 SOLUCIÓN ÁRGENTICA Hexametileutetramina(Metenamina) 3% (ha de conservarse en nevera) Hexametileutetramina 3 gr Nitrato de plata 10 % Nitrato de plata 10 gr Solución de borax 2 % Borax (tetraborato sódico) 2 gr SOLUCIÓN ARGÉNTICA DE TRABAJO (DEBE SER SIEMPRE TRANSPARENTE) contenedor Hexametileutetramina 80 ml 8 ml Nitrato de plata 5 ml 0.5 ml 5 ml 0.5 ml Boráx 10 ml 1 ml SOLUCIÓN ÁCIDO PERYÓDICO 1 % Ácido peryódico 1 gr SOLUCIÓN TIOSULFATO SÓDICO 3 % Tiosulfato sódico 3 gr SOLUCIÓN ACETONA 10 % Acetona 10 ml 90 ml SOLUCIÓN HEMATOXILINA DE HARRIS Solución comercial de Merck SOLUCIÓN ALCOHOL-ÁCIDO 1 % Ácido clorhídrico Alcohol etílico 70 % 1 ml 99 ml SOLUCIÓN DE EOSINA SOLUCIÓN EOSINA MADRE Eosina Alcohol 96 % 10 gr 200 ml 800 ml
7 PATOLOGICA Página 7 de 16 SOLUCIÓN DE EOSINA DE TRABAJO Eosina madre Alcohol 80 % Ácido acético PAS FIJACION: Formalina neutra tamponada al 10%. 500 ml 1500 ml 10 ml 2. Oxidar en la solución de ácido periódico 0.5 % durante 10 minutos. 3. Lavar en agua corriente. 4. Colocar en el reactivo de Schiff durante minutos. 5. Lavar con agua corriente templada durante 5 minutos. 6. Contrastar con la solución de hematoxilina de Harris durante 1 minuto. 7. Lavar con agua corriente durante 5 minutos. 8. Diferenciar con alcohol ácido 1 % 10 segundos. 9. Lavar en agua corriente 2 minutos. 10. Deshidratar en alcoholes crecientes (70º, 96º y absoluto) durante 2 minutos. 11. Xilol durante 5 minutos. 12. Montar con DPX. SOLUCION ACIDO PERYÓDICO AL 0.5 % Ácido periódico 0.5 g SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO 1 % Ácido clorhídrico Alcohol 70 1 ml REACTIVO DE SCHIFF SOLUCION DE HEMATOXILINA DE HARRIS Núcleos Glucógeno, mucina y algunas membranas básales Hongos Azul. Rojo a púrpura. Rojo a púrpura. GIEMSA FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10%.
8 PATOLOGICA Página 8 de Poner los cortes en la solución de Giemsa de trabajo 1 hora a temperatura ambiente. 3. Lavar con solución agua ácida durante 30 segundos. 4. Deshidratar en alcoholes crecientes (96º y absoluto) con pasos breves. 5. Xilol con pases breves y montar con DPX inmediatamente. SOLUCIÓN GIEMSA DE TRABAJO Giemsa SOLUCIÓN AGUA ÁCIDA Ácido acético glacial 20 ml 80 ml 4 gotas Núcleos Citoplasma Eritrocitos Azul Rosa Rojo FIJACION: Formalina neutra al 10 % MUCICARMIN DE MAYER 1 Desparafinar e hidratar hasta llegar al agua destilada. 2. Colocar en la solución diaria de hematoxilina de hierro de Weigert durante 7 minutos. 3. Lavar brevemente con agua corriente. 4. Lavar con la solución diluida de alcohol ácido durante 1 minuto. 5. Lavar con agua corriente durante 10 minutos. 6. Teñir durante 30 minutos con la SOLUCIÓN DE TRABAJO DEL MUCICARMIN (esta se debe preparar en el día y después se ha de tirar). 7. Lavar rápidamente con agua destilada. 8. Contrastar con la solución de amarillo de metanilo durante 1 minuto. 9. Deshidratar en alcoholes crecientes (70º, 96º y absoluto) durante 2 minutos. 10. Xilol durante 5 minutos. 11. Montar con DPX. SOLUCIÓN MADRE DEL MUCICARMIN Carmín 1 gr.
9 PATOLOGICA Página 9 de 16 Hidróxido de Aluminio 1 gr. Alcohol etílico 50 % Poner los reactivos en una botella o matraz de 500 ml y agitar hasta su total disolución. Agregar en pequeñas cantidades, poco a poco y agitando : Cloruro de Aluminio Anhidro 0.5 gr. Preparar un baño maría con agua a punto de ebullición. Colocar el matraz en el baño, cuando empiece a hervir la solución dejar 3 minutos (no más). Enfriar rápidamente con agua del grifo. Cuando esté fría, filtrar y rotular. SOLUCIÓN DE TRABAJO DEL MUCICARMIN Solución madre del mucicarmin 1 parte 9 partes SOLUCIÓN DILUÍDA DE ALCOHOL-ÁCIDO Alcohol ácido al 1% 10 ml 90 ml SOLUCIÓN AMARILLO DE METALINO Amarillo de metalino Ácido acético glacial 0.25 gr ml SOLUCIÓN HEMATOXILINA DE WEIGERT (temporalmente usar la solución A y B del kit del Tricrómico de Masson). Mezclar a partes iguales la solución A y B. Mucina Cápsula de criptococos Núcleos Fondo Rosado oscuro Rosado oscuro Negro Amarillo ORCEÍNA FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10 %. 2. Poner la solución mordiente durante 5 minutos. 3. Decolorar con solución ácido oxálico durante 1 minuto. 4. Lavar en agua corriente durante 3 minutos.
10 PATOLOGICA Página 10 de Lavar en agua destilada durante 3 minutos. 6. Poner en solución de orceína durante 30 minutos. 7. Deshidratar en alcoholes crecientes (96º y absoluto) durante 2 minutos. 8. Xilol durante 5 minutos. 9. Montar con DPX. SOLUCIÓN MORDIENTE Permanganato potásico Ácido sulfúrico 3% 0.5 gr 5 ml 95 ml SOLUCIÓN DE ORCEINA orceína Alcohol 70º Ácido clorhídrico ph de gr 99 ml 1 ml SOLUCIÓN DE ÁCIDO OXÁLICO Ácido oxálico 2 gr Fibras y membranas elásticas Pardo Negruzco PAS DIASTASA FIJACION: Formalina neutra tamponada al 10%. 2. Colocar los cortes en solución diastasa (previamente puesta a temperatura ambiente) en estufa durante 45 minutos a 60º C. 3. Lavar en agua corriente durante 5 minutos. 4. Oxidar en la solución de ácido periódico 0.5% durante 10 minutos 5. Lavar en agua corriente durante 5 minutos. 6. Colocar en el reactivo de Schiff durante minutos. 7. Lavar con agua corriente templada durante 5 minutos. 8. Contrastar con la solución de hematoxilina de Harris durante 1 minuto. 9. Lavar con agua corriente durante 5 minutos. 10. Diferenciar con alcohol ácido 1% 10 segundos. 11. Lavar en agua corriente 2 minutos. 12. Deshidratar en alcoholes crecientes (70º, 96º y absoluto) durante 2 minutos. 13. Xilol durante 5 minutos.
11 PATOLOGICA Página 11 de Montar con DPX. SOLUCION ACIDO PERYÓDICO AL 0.5% Ácido periódico 0.5 gr SOLUCION DE ACIDO CLORHIDRICO 1 % Ácido clorhídrico Alcohol 70 1 ml REACTIVO DE SCHIFF SOLUCION DE HEMATOXILINA DE HARRIS SOLUCIÓN FOSFATO ESTABILIZADORA ph 6.0 Cloruro de sodio Fosfato de sodio dibásico Fosfato de sodio monobásico 8 gr 0.28 gr 1.97 gr SOLUCIÓN DIASTASA Diastasa Solución fosfato estabilizadora 0.1 gr Núcleos Mucina y algunas membranas básales Hongos Glucógeno Azul Rojo a púrpura Rojo a púrpura Sin color TRICRÓMICO DE MASSON FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10 %. 2. Mezclar en placa de petri la misma cantidad de gotas de la solución A que de la solución B, poner dicha mezcla sobre el corte durante 10 minutos. 3. Sin lavar, decantar el cristal y poner sobre el corte la solución C durante 4 minutos. 4. Lavar rápidamente en agua destilada dejando el corte de color amarillo, poner sobre el corte la solución D durante 4 minutos. 5. Lavar en agua destilada y poner sobre el corte la solución E durante 10 minutos.
12 PATOLOGICA Página 12 de Sin lavar, decantar el cristal y poner sobre el corte la solución F durante 20 minutos. 7. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 8. Deshidratar en alcoholes crecientes (96º y absoluto) con pasos muy rápidos para no perder el contraste del verde luz. 9. Xilol pases breves. 10. Montar con DPX rápidamente. SOLUCIÓN A (comercial) SOLUCIÓN B (comercial) SOLUCIÓN C (comercial) SOLUCIÓN D (comercial) SOLUCIÓN E (comercial) SOLUCIÓN F (comercial) Núcleos y gametos Citoplasma, queratina y músculo Colágeno y moco Eritrocitos Negro Rojo Verde Amarillo FIBRAS RETICULARES FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10 %. 2. Mezclar en placa de petri la misma cantidad de gotas de la solución A que de la solución B, poner dicha mezcla sobre el corte durante 5 minutos. 3. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 4. Poner sobre el corte la solución C durante 3 minutos. 5. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 6. Poner sobre el corte la solución D durante 3 minutos. 7. Lavar dos veces en agua destilada durante 2 minutos. 8. Poner sobre el corte la solución E durante 3 minutos. 9. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 10. Poner sobre el corte la solución F durante 5 minutos. 11. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 12. Poner sobre el corte la solución G durante 5 minutos. 13. Lavar en agua corriente durante 5 minutos. 14. Deshidratar en alcoholes crecientes (96º y absoluto) durante 2 minutos. 15. Xilol durante 5 minutos. SOLUCIÓN A (comercial)
13 PATOLOGICA Página 13 de 16 SOLUCIÓN B (comercial) SOLUCIÓN C (comercial) SOLUCIÓN D (comercial) SOLUCIÓN E (comercial) SOLUCIÓN F (comercial) SOLUCIÓN G (comercial) Fibras reticulares y nerviosas Tejido conectivo Colágeno negro pardo amarillo GRAM FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10 % o alcohol 96 º para citologías 2. Solución Violeta de Metilo al 1 % durante 3 minutos. 3. Lavar con agua destilada. 4. Solución yodada de Gram durante 3 minutos. 5. Lavar con agua destilada. 6. Decolorar con acetona durante10 segundos. 7. Lavar con agua destilada. 8. Solución Rojo Neutro al 1 % durante 2 minutos. 9. Lavar en agua destilada. 10. Deshidratar en alcoholes crecientes (96º y absoluto) durante2 minutos. 11. Xilol durante 5 minutos. 12. Montar con DPX. SOLUCIÓN VIOLETA DE METILO AL 1 % Violeta de metilo 1 g SOLUCION YODADA DE GRAM Yodo Yoduro potásico SOLUCION ROJO NEUTRO AL 1 % Rojo neutro 1 g 2 g 1 g
14 PATOLOGICA Página 14 de 16 Gérmenes Gram + Gérmenes Gram - Núcleos Azul/Negro Rojo Rojo ROJO CONGO FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10 %. 2. Colorear con una solución filtrada de Rojo Congo 1% durante 60 minutos. 4. Diferenciar en solución de hidróxido potásico al 0.2% durante 4 segundos. 5. Lavar con agua corriente durante 5 minutos. 6. Contrastar con la solución de hematoxilina de Harris durante 10 segundos. 7. Lavar con agua corriente durante 5 minutos. 8. Deshidratar en alcoholes crecientes (96º y absoluto) durante 2 minutos. 9. Xilol durante 5 minutos. 10. Montar con DPX. SOLUCIÓN DEL ROJO CONGO AL 1% Rojo Congo SOLUCIÓN DE HIDRÓXIDO DE POTASIO AL 0.2 % Hidróxido de potasio Alcohol 80 1 gr 0.2 gr SOLUCIÓN DE HEMATOXILINA DE HARRIS Amiloide polarizada Núcleos rosado a rojo, y manzana verdoso bajo luz azul PLATA METENAMINA FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10 %. 2. Poner sobre el corte la solución A durante 30 minutos. 3. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 4. Preparar una cámara húmeda.
15 PATOLOGICA Página 15 de Mezclar 10 gotas de la solución B, 10 gotas de la solución C y 10 gotas de la solución D. 6. Agitar bien la solución. 7. Colocar los cristales en la cámara húmeda y poner la solución, incubando en estufa a 60 º C durante 30 minutos. 8. Dejar enfriar durante 5-10 minutos. 9. Poner sobre el corte la solución E durante 1 minuto. 10. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 11. Poner sobre el corte la solución F durante 1 minuto. 12. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 13. Contrateñir con solución verde luz durante 20 segundos. 14. Lavar en agua destilada durante 2 minutos. 15. Deshidratar en alcoholes crecientes (96º y absoluto) con pases rápidos para no perder el verde luz. 16. Xilol durante 5 minutos 17. Montar con DPX. SOLUCIÓN A (comercial) SOLUCIÓN B (comercial) SOLUCIÓN C (comercial) SOLUCIÓN D (comercial) SOLUCIÓN E (comercial) SOLUCIÓN F (comercial) SOLUCIÓN VERDE LUZ (comercial) Hongos Fondo Negro Verde ZIEHL NEELSEN FIJACIÓN: Formalina neutra tamponada al 10 %. 2. Poner el corte en fucsina a temperatura ambiente 30 minutos. 3. Lavar en agua corriente durante 2 minutos. 4. Poner el corte en la solución de alcohol ácido al 1 % hasta que el corte no suelte colorante. 5. Lavar en agua corriente durante 2 minutos. 6. Poner el corte en la solución de azul de metileno de Merck durante 5 segundos. 7. Lavar en agua corriente durante 5 minutos. 8. Lavar en agua destilada. 9. Deshidratar en alcoholes crecientes (96º y absoluto) observando el corte que debe quedar con un tono azul pálido (para poder ver los bacilos). 10. Xilol durante 5 minutos.
16 PATOLOGICA Página 16 de Montar con DPX. SOLUCIÓN DE FUCSINA (comercial) SOLUCIÓN DE ALCOHOL ÁCIDO 1% SOLUCIÓN AZUL DE METILENO (comercial) Núcleos Bacilos de Koch Azul Rojo
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