Susana Córdoba INEI. ANLIS. Dr. C. G. Malbrán

Transcripción

1 Pruebas de susceptibilidad in vitro Susana Córdoba INEI. ANLIS. Dr. C. G. Malbrán

2 Métodos en dilución M27-A3, Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI) E. Def. 7.1, EUCAST Métodos por difusión M44-A2, CLSI Otros métodos de difusión: Etest, tabletas, discos FCZ Malbrán

3 Panorama de las infecciones fúngicas invasoras a partir de la década de los 80

4 Marcado incremento IFO Número de casos anuales de sepsis por hongos se incrementó un 207% entre Causa importante de morbilidad y mortalidad hasta 40 % mortalidad en candidiasis sistémica Incremento población VIH/SIDA Cambios en la práctica médica 207% Drogas inmunosupresoras Quimioterapia citotóxica Uso de catéter Antibióticos amplio espectro Incremento de transplantes de órganos Martin NEJM, 2003

5 Consideraciones Candida spp. Candida spp. es el Género fúngico que causa la mayoría de las infecciones invasoras. El mayor número de mecanismos de resistencia se describe en el Género Candida.

6 Evolución histórica de los antifúngicos Anfotericina B Flucitosina Ketoconazol Fluconazol Itraconazol Caspofungina Voriconazol Ravuconazol Posaconazol Albaconazol Otros Formulaciones lipídicas de la AMB Micafungina Anidulafungina Aminofungina

7 Aumento del nº de infecciones Aumento del uso de los antifúngicos RI R2ª Somos capaces de identificar las cepas o especies resistentes?

8 Pruebas de susceptibilidad in vitro Cuando se recomienda estudiar la susceptibilidad de una levadura? Cómo se estudia la susceptibilidad a los antifúngicos?? Cuales son los valores de corte para considerar una levadura susceptible o resistente a los antifúngico? Son comparables los resultados de susceptibilidad hechos por difusión con discos, Etest y en medio líquido?

9 Pruebas de susceptibilidad in vitro Cuando se recomienda estudiar la sensibilidad de una levadura? VIH / SIDA Enfermos con profilaxis Inmunodepresión Fallos terapéuticos Micosis invasoras Especies no frecuentes Estudios epidemiológicos

10 Pruebas de susceptibilidad in vitro Cuando se recomienda estudiar la susceptibilidad de una levadura?!!seguro,!!!! Debemos hacer estudios de susceptibilidad. Algo me sugiere que puede ser una cepa resistente

11 Pruebas de susceptibilidad Concepto Estas pruebas están encaminadas a conocer si los microorganismos testados son susceptibles o resistentes a los antimicrobianos

12 Pruebas de susceptibilidad La determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), es la forma más sencilla de identificar AISLAMIENTOS RESISTENTES

13 Pruebas de susceptibilidad Utilidad Tratamiento empírico Tratamiento directo Política de control de la infección Descubrimiento de nuevas moléculas Correlación in vitro-in vivo

14 Pruebas de susceptibilidad in vitro Cuando se recomienda estudiar la susceptibilidad de una levadura? Cómo se estudia la susceptibilidad a los antifúngicos??

15 Género Candida Susceptibilidad in vitro

16 Levaduras: Detección de la Resistencia C I M CLSI : M27-A3: Levaduras Macro y microdilución EUCAST E. Def 7.1 : E-TEST Levaduras fermentadoras Microdilución TABLETAS: Neo Sensitabs- Rosco DISCOS DE PAPEL: M44-A CLSI DISCOS DE PAPEL: Fluconazol Malbrán A G A R

17 Levaduras M27-A, CLSI Diseñado para evaluar levaduras que causan infecciones invasoras: Candida spp. Cryptococcus neoformans Hongos miceliales Hongos dimórficos

18 M27-A. Antifúngicos ngicos Intervalo de concentraciones Debe incluir los puntos críticos de cada antimicrobiano Debe incluir las CIMs de las cepas de control de calidad Antifúngico Intervalo (ug/ml) Anfotericina B 16-0,0313 Fluorocitosina 64-0,125 Ketoconazol 16-0,0313 Fluconazol 64-0,125 Itraconazol 16-0,0313 Voriconazol 16-0,0313 Ravuconazol 16-0,0313 Posaconazol 16-0,0313 Caspofungina 16-0,0313 Anidulafungina 16-0,0313

19 M27-A. Placa de microdilución AB, 5-FC Kz, Iz,Vor, y Fluconazol Rv, Ps A BC D EFG H ,5 2 0,25 1 0, , , CC CE

20 M27-A. Lectura de resultados La CIM es la concentración más baja de antifúngico que inhibe sustancialmente el crecimiento del microorganismo detectado visualmente

21 M27-A. Lectura de resultados Anfotericina B La CIM se corresponde con aquel tubo/pocillo en el que no se detecta crecimiento (Ópticamente claro=0) Azoles, 5-FC, equinocandinas La CIM se corresponde con aquel tubo/pocillo en el que se detecta el 50% o menos de crecimiento (disminución prominente de la turbidez=2)

22 Pruebas de susceptibilidad in vitro Cuando se recomienda estudiar la susceptibilidad de una levadura? Cómo se estudia la susceptibilidad a los antifúngicos?? Cuales son los valores de corte para considerar una levadura susceptible o resistente a los antifúngico?

23 Puntos de Corte M27-A, CLSI CLSI, Reference Method for Broth Dilution for Antifungal Susceptibility Testing of Yeast, Approved Standard, Third Edition CLSI Document M27-A3 Voriconazol (*) < 1 2 > 4 Equinocandinas (**) < 2 N/D N/D (*) Pfaller, M. A., et al J. Clin. Microbiol. 44: (**) M27-A CLSI Document

24 Métodos de Susceptibilidad E-test Discos FCZ? M27-A E.Def. 7.1 Tabletas E.Def. 9.1

25 Diferencias entre M27-A (CLSI) y E. Def 7.1 (EUCAST) CLSI M27-A D.Def 7.1 EUCAST-AFST AFST Cryptococcus Anfotericina B Glucosa Forma del pocillo Inóculo (UFC/mL) Incubación (h) Lectura CIM incluido incluido 0,2 % Fondo redondo 0,5 2,5 x visual Más s baja concentración que inhibe sustancialmente el crecimiento excluido excluido 2% Fondo plano 0,5 2,5 x espectrofotómetro Más s baja concentración n que inhibe el crecimiento al menos un 50%

26 Fluconazol. Puntos de Corte E.Def 7.1. EUCAST Susceptible Intermedio Resistente Puntos de corte. < 2 mg/l 4 mg/l > 4 mg/l Aplicable a: C. albicans C. parapsilosis C. tropicalis NO SE APLICA A: C. krusei C. glabrata

27 POLIENOS Uso Clínico de la AMB Candidosis invasoras Criptococosis grave o del SNC (asociada con 5- fluorocitosina) Micosis primarias graves o en inmunodeprimidos Histoplasmosis, blastomicosis, esporotricosis, coccidioidomicosis, paracoccidioidomicosis. POCA EFICACIA en aspergilosis, zigomicosis y otras micosis oportunistas

28 POLIENOS Anfotericina B Resistencia intrínseca: nseca: Scedosporium spp. Trichosporon spp. Fusarium spp. Hongos dematiáceos Resistencia primaria: No existe en aquellas especies que son sensibles a este grupo de antifúngicos Candida haemulonii? L. Rodero, M. Cuenca Estrella, S. Córdoba, P. Cahn, G. Davel, S. Kaufman, L. Guelfand, JL Rodriguez Tudela. JCM: 2002.

29 Candida haemulonii AMB CIMs (µg/ml) AM3 RPMI + 2% G 24 h 48 h 24 h 48 h CIMs (µg/ml) 5-FC FCZ KTZ ITZ Log (CFU/ml) Amphotericin (8 ug/ml) Time (h) Control Ch AMB Ch Control Ca AMB Ca Córdoba S., Guelfand L., Rodríguez Tudela J.L., Cahn P., Davel G., Kaufman S. & Rodero L. ICAAC 2000 L. Rodero, M. Cuenca Estrella, S. Córdoba, P. Cahn, G. Davel, S. Kaufman, L. Guelfand, JL Rodriguez Tudela. JCM: 2002.

30 Vigilancia de la resistencia ESPECIES DE LEVADURAS AISLADAS DE HEMOCULTIVO CON MAYOR FRECUENCIA Córdoba y col., 47 Hosp. 13 Pcias y CABA Junio 2007 Junio 2008 Susceptibilidad in vitro Rodero y col, 36 Hosp. 9 Pcias y CABA abril de abril de 2000 % de resistentes Especie Período n FCZ ITZ AMB Candida albicans , C. parapsilosis C. tropicalis , ,3 0 2,5

31 Uso clínico de los Azoles Candidosis invasoras Criptococosis Tratamiento de mantenimiento Micosis primarias En las localizadas y mantenimiento en inmunodeprimidos Aspergilosis, Zigomicosis y otras micosis Fluconazol es inactivo frente a la mayoría de hongos miceliales Itraconazol en las no graves, refuerzo, profilaxis Voriconazol amplio espectro frente a hongos miceliales y levaduras

32 Nuevos Azoles Posaconazol (Schering-Plough, SCH-56592) Indicaciones Actividad similar a otros triazoles en levaduras Mejor actividad en Aspergillus CIM: 0,12 mg/l Resistencia cruzada en otros hongos filamentosos Cuenca-Estrella et al. AAC. 2006

33 Nuevos Azoles Posaconazol: Indicaciones Aspergilosis Fusariosis Cromoblastomicosis Micetoma Coccidioidomicosis Refractaria a otros antifúngicos Grave COF o en pacientes inmunodeprimidos Profilaxis de la candidosis y aspergilosis invasora en pacientes de alto riesgo

34 Equinocandinas Anidulafungina Candida spp. n=190 % Resistencia. Antifúngicos AMB FCZ ITZ VCZ AN Especie (n) >1 > C albicans (73) 1,4 5,5 1,4 1,4 0 C tropicalis (36) 2,8 11 5,6 8,3 0 C parapsilosis (33) C glabrata (19) C krusei (5) Córdoba S. y col. VI CLAM 2008

35 Equinocandinas Anidulafungina Candida spp. n=190 % Resistencia. Antifúngicos AMB FCZ ITZ VCZ AN Especie (n) >1 > C. dubliniensis (6) C. lusitaniae (5) C. guilliermondii (3) C. haemulonii (3) C. inconspicua (2) Córdoba S. y col. VI CLAM 2008

36 Candida spp. Susceptibilidad Ca Ct Cp Cg Ck Cgui Cl FCZ ITZ, VCZ PZ, RZ Echi AMB Guidelines for treatment of Candidiasis, IDSA 2009

37 Cryptococcus neoformans Susceptibilidad in vitro n= 332 CIM, M27-A2 CLSI modificado Rango CIM 50 % Resistencia Anfotericina B 0, Fluconazol 0, Itraconazol <0, ,03 0 Voriconazol <0, , Córdoba S, 2007

38 Cryptococcus spp... No desarrolla bien con las condiciones del M27-A (CLSI) El E. Def.7.1 (EUCAST) no lo incluye Necesita agitación Alternativas Curvas de letalidad para AMB separan poblaciones: -Sensibles y no-sensibles -distinta susceptibilidad en el tiempo Tablero de ajedrez Concentración fungicida mínima

39 Cryptococcus spp... Curvas de letalidad Anfotericina B 1µg/mL + 5-Fluorocitosina 10 µg/ml 7 6 Log 10 (CFU/ml) Tiempo (h) Promedio control de crecimiento Promedio aislamientos: 2672, 1130 y 2294

40 Cryptococcus spp... Curvas de letalidad Anfotericina B 1µg/mL + Rifampicina 5 µg/ml 7 Log 10 (UFC/ml) Tiempo (h) Promedio control de crecimiento Promedio de los aislamientos: 399, 947, 2672, 2294

41 Cryptococcus neoformans var. grubii y C. gattii: aislamientos autóctonos ambientales. Determinación de la sensibilidad in vitro a los antifúngicos de uso convencional Córdoba S., y col cepas de C. gattii y 8 de C n var. grubii provenientes del medio ambiente, frente a anfotericina B, 5-Fluorocitosina, itraconazol, fluconazol y voriconazol CIM: Susceptibilidad in vitro: Cryptococcus Microdilución gattii, 78% (EUCAST fueron con susceptibles modificaciones) a FCZ y el 22% sensible dependiente de dosis, mientras Curvas que de muerte para ITZ, 5FC, VCZ y AMB todos fueron susceptibles. Todos los aislamientos de Cn var. grubii fueron susceptibles a los antifúngicos evaluados. Curvas de Muerte: Curva de muerte C. gattii frente a anfotericina B El 5% de los C. gattii y el 25% de los C. n var. grubii, fueron tolerantes a anfotericina B Tiempo horas

42 Cryptococcus spp. Concentración Fungicida Mínima =99,99% (-log 10 3) UFC CIM ,5 0,25 0,12 CC CE 100 µl 100 µl

43 Cryptococcus spp... Tablero de ajedrez 5FC ,5 0,25 0, Antimicrobianos: Anfotericina B, sola y en combinación con rifampicina, 5-fluorocitosina, voriconazol. Medio de cultivo: RPMI 1640 (Sigma, Chemical Co, St. Luis USA). Inóculo: 0,5 McFarland en solución salina 0,85% (1-5 x 10 6 UCF/ml). Microorganismo control: Cryptococcus neoformans ATCC Incubación: 48 h a 30ºC en agitación 350 rpm. Lectura: Visual. AMB A 4 B 4/2 4/1 2 C 2/1 1 D Combinaciones de AMB + 5FC 0,5 E 0,25 F 0,12 G 0,06 Interpretación: H Sinergia: CIFI 0,5. Indiferencia: CIFI 1-4 Adición: CIFI > Antagonismo: CIFI > 4. Córdoba S., 2007 B L A N C O

44 Conclusión parcial... Los resultados que se obtienen con los métodos estándar para determinar la susceptibilidad in vitro en cepas de Cryptococcus spp. no permiten predecir la evolución clínica, siendo solo de utilidad para evaluar susceptibilidad in vitro a los azoles. El tablero de ajedrez es útil para valorar si hay sinergia in vitro, pero el resultado no siempre tiene su correspondencia con lo que ocurre in vivo. La determinación de la concentración fungicida mínima constituye una herramienta de utilidad con una mayor aproximación a la evolución clínica.

45 Conclusión parcial... La curva de letalidad permite identificar cepas de Cryptococcus neoformans tolerantes a anfotericina B, y además, los datos que aporta, tienen correlación con la evolución clínica. La curva de letalidad permite evidenciar la inhibición de Cryptococcus neoformans in vitro frente a distintas combinaciones de antifúngicos, constituyéndose en una alternativa de utilidad para el manejo terapéutico de aquellos pacientes que presentan fallas en el tratamiento convencional o recidivas.

46 Pruebas de susceptibilidad in vitro Cuando se recomienda estudiar la susceptibilidad de una levadura? Cómo se estudia la susceptibilidad a los antifúngicos?? Cuales son los valores de corte para considerar una levadura susceptible o resistente a los antifúngico? Son comparables los resultados de susceptibilidad hechos por difusión con discos, Etest y en medio líquido?

47 Métodos de referencia Reproducibles inter e intralaboratorio Distinguen poblaciones sensibles de resistentes Acercamiento a la correlación clinica Prevención del fallo terapéutico Pero..son costosos, laboriosos y de difícil aplicación en los laboratorios hospitalarios

48 Métodos comerciales Cualitativos Tabletas Discos AB Difusión en agar KZ FZ 5FC IZ Colorimétricos Sensititre Cuantitativos. CIM E-test NO SON DE REFERENCIA AB 32 0,002

49 Difusión en agar Ventajas Simple de realizar Resultados rápidos Bajo costo

50 Difusión en agar Inconvenientes Subjetividad en la lectura de los halos Lectura a 24 o 48 horas según las especies Inóculo adecuado Carga de antifúngico apropiada Reproducibilidad intra e interlaboratorio

51 Discos de Fluconazol M44-A. CLSI 2004 FZ

52 DISCOS DE FLUCONAZOL Estudio Multicéntrico Internacional: levaduras, 40 Hospitales, 26 países r: 0,83 CLSI: A Standard Agar Disk Diffusion Method for Antifungal Susceptibility Testing J. Meis y col. DMID, 36: M44-A Discos: ug ugde fluconazol Medio: Agar Mueller-Hinton + 2% 2% glucosa + Azul de de Metileno Inóculo: 5 x UFC/ml Incubación: h, h, 35ºC (excepto C. C. neoformans h, h, 30ºC) Lectura de de la la zona de de inhibición: automatizado, cámara de de video BIOMIC y 80% 80% de de inhibición mediante un un software.

53 Difusión vs. microdilución, CLSI J Clin Microbiol, 2005, p países, 127 laboratorios. 140,767 levaduras, desde junio 1997 a diciembre M44-A, CLSI. Lectura de las placas automatizada (BIOMIC Vision Image Analysis System). M27-A2 Microdilución, CLSI. Antifúngicos: fluconazol, voriconazol.

54 Difusión vs. microdilución, CLSI J CLIN MICROBIOL, 2005, p Concordancia entre difusión y microdilución para fluconazol y voriconazol % Resultados Antifúngico (n) Método S SDD R % Concordancia % Errores EVM EM M Fluconazol (2,949) Ref.-CIM Part.-disco Voriconazol (2,934) Ref.-CIM Part.-disco

55 Difusión: M44-A CLSI Puntos de corte Pfaller M. J Clin Microbiol, 2005, p S S-DD R Fluconazol M27-A2 µg/ml < > 64 M44-A mm > < 14 Voriconazol M27-A2 µg/ml < 1 2 > 4 M44-A mm > < 13

56 Difusión con disco fluconazol Malbrán ( ) Método: CLSI M2-A6 discos para bacterias Discos: 25 ug de fluconazol (cargados en el laboratorio) Medio: Mueller-Hinton + 2% glucosa + Azul de Metileno Inóculo: 5 x 10 6 UFC/mL Incubación: 24 h, 35ºC; C. parapsilosis 48 h. Lectura de la zona de inhibición: Visual Rodero L., Córdoba S., Vivot W., Campo M., Corfield P., Olguín C, Cuirolo A., Soria M., Guelfand L., Canteros CE., Davel G. (2006) Rev. Argent. Microbiol. 38:

57 Difusión con disco de FCZ 25 ug Puntos de corte n=1327 Puntos de corte Sensibles Sensibles dependiente de la dosis Resistente Halo (mm) Discos de 25 ug Determinar por CIM Rodero L., Córdoba S., Vivot W., Campo M., Corfield P., Olguín C, Cuirolo A., Soria M., Guelfand L., Canteros CE., Davel G. (2006) Rev. Argent. Microbiol. 38:

58 C. albicans Fluconazol (susceptible) Candida krusei Fluconazol resistente

59 Tabletas Neo-Sensitabs Medio de cultivo: Agar Mueller Hinton + 2% G + Azul Metileno Inóculo: 10 6 UFC/mL Tiempo de incubación: 24 y 48 h Temperatura: 35 C

60 Tabletas Neo-Sensitabs Itraconazol Fluconazol Itraconazol Fluconazol Interpretación de los resultados Diámetro del halo en mm CIM (mg/l) Antifúngico Sensible Intermedia Resistente Sensible Resistente Anfotericina B < Fluconazol Itraconazol < Voriconazol

61 Difusión: E-test Medio de cultivo: RPMI agar + 2% G Inóculo: 10 6 UFC/mL Incubación: 24 y 48 h Antifúngico Fluconazol- Anfotericina B

62 Otros métodos Tabletas, discos Malbrán, Oxoid vs. E. Def 7.1 (EUCAST) Candida spp. n=200 Córdoba y col., III Jornadas Microbiología, 2009

63 Otros métodos Tabletas, discos Malbrán, Oxoid vs. E. Def 7.1 (EUCAST) Candida spp. n=200 Porcentaje de concordancia con el método de referencia DISCOS MALBRÁN TABLETAS ROSCO DISCOS OXOID FCZ FCZ VCZ FCZ VCZ 91,0 78,4 95,08 81,96 95,08 Córdoba y col., III Jornadas Microbiología, 2009

64 Correlación entre EUCAST y cuatro técnicas comerciales Cuenca-Estrella M, CMI aislamientos clínicos de Candida spp. EUCAST vs. Sensititre YeastOne, Etest, Fungitest, Neo-Sensitabs Concordancia EUCAST vs. Sensititre YeastOne, 75% Etest, 90.4% Correlación EUCAST y Sensititre YeastOne 0.92 Etest 0.89 Neo-Sensitabs (>5% de EVM con FCZ) Fungitest 0,95

65 Conclusiones I Levaduras El laboratorio puede detectar aislamientos de Candida spp. resistentes a los azoles con confianza, pero empleando métodos estandarizados. Es poco frecuente el hallazgo de resistencia en aislados clínicos de Candida albicans. La detección de resistencia a AMB está en proceso de investigación. Si bien no es necesario realizar pruebas de susceptibilidad en forma rutinaria recordar que: C. albicans C. dubliniensis C. tropicalis C. parapsilosis pueden desarrollar resistencia secundaria a azoles C. glabrata menor susceptibilidad a azoles C. krusei es insensible a fluconazol PARA OTRAS ESPECIES, CONSULTAR!!!

66 Conclusiones II... Difusión en agar Los métodos por difusión con disco, tabletas, o tiras de E-test son útiles para los laboratorios clínicos La difusión es rápida y económica y sirve como tamiz Etest es costoso, detecta resistencia a los azoles y AMB. Trailing

67 MUCHAS GRACIAS!! Y espero no...