CITOMETRIA DE FLUJO EN LA EVALUACION DE POTENCIAL DE MEMBRANA Y VIABILIDAD CELULAR DE Helicobacter pylori

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1 UNIVERSIDAD DE CONCEPCION ESCUELA DE GRADUADOS MAGISTER EN CIENCIAS MENCION MICROBIOLOGIA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS CITOMETRIA DE FLUJO EN LA EVALUACION DE POTENCIAL DE MEMBRANA Y VIABILIDAD CELULAR DE Helicobacter pylori JUAN LUIS CASTILLO NAVARRETE CONCEPCION, CHILE 2005

2 i UNIVERSIDAD DE CONCEPCIÓN ESCUELA DE GRADUADOS Esta tesis ha sido realizada en el Laboratorio de Patogenicidad Bacteriana, Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción y en Laboratorio de Citometría de Flujo del Hospital del Trabajador, y ha sido aprobada por la siguiente Comisión de Evaluación: Dra. Apolinaria García C. Bioquímico. Magíster en Tecnología del DNA Recombinante. Magíster en Microbiología. Doctor en Ciencias Biológicas. Dr. Carlos González C. Bioquímico. Magíster en Microbiología Doctor en Ciencias Profesor Guía Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción Comité de Tesis Facultad de Ciencias Biológicas Universidad de Concepción Dr. Fernando Kawaguchi P. Médico Gastroenterológo Doctor en Medicina Comité de Tesis Facultad de Medicina Universidad de Concepción Dr. Jaime Madariaga B. Médico Anatomopatólogo Dr. Gerardo González R. Licenciado en Biología. Magíster en Microbiología Doctor en Ciencias Biológicas Comité de Tesis Facultad de Medicina Universidad de Concepción Jefe de Programa Magíster en Ciencias con Mención Microbiología

3 ii Different people see microorganisms from different perspectives Howard M. Shapiro

4 iii Con amor a Carmen Gloria, Francisco, Loreto, Cristina, Tata, Tete y Marcelo

5 iv AGRADECIMIENTOS Agradecimientos, sin duda lo más difícil de esta tesis, la cual al igual que las asignaturas del programa de Magíster, no habrían prosperado sin el aliento constante de muchos, la ayuda de otros y el apoyo incondicional de aquellos. Son muchos los que se me escaparán, pero a ellos también les debo mucho. Agradezco y reconozco públicamente, que sin el apoyo incondicional, paciencia, consejos y amor de Carmen Gloria, esta empresa no habría llegado a puerto; no puedo dejar de recordar aquellas noches de certámenes, en los me acompañó en mi vigilia para que no me durmiera, así como también sus constantes tu eres capaz.. Gracias y perdón por el tiempo que no te entregué. A Francisco, mi hijo y padawan, por su paciencia, comprensión (en especial cuando me decía ya sé papá, es tu trabajo.) y por su entereza al decirme las cosas de frente. A mi princesa Loreto, que con su cariño espontáneo me recargó mis baterías en innumerables ocasiones. A la Señorita Titi, Cristina, mi hija, mi araña peluda, la cual llegó a mi vida a fines del primer año de Magíster, y que desde entonces sólo me ha entregado amor incondicional junto con el misterio de la profundidad de sus ojos Como no agradecer a mi Padre, quién desde niño me inculcó las bases para buscar información y siempre ir más allá en la búsqueda del conocimiento, por muy particular que este sea. Además con su ejemplo de tesón, entrega y sacrificio, así

6 v como entrañable amor me ha apoyado en mis locuras y siempre me ayudado a levantarme, cuando ha sido necesario..para ti papito.. Y que decir la chica, mi madre que con su paciencia y sencillez, hasta la fecha (y gracias a Dios), me acompaña y apoya. Un abrazo de agradecimiento a mi colega, compadre y hermano Marcelo, quién siempre me acompañado en mis tonteras y locuras y con quién tuve el privilegio de ser compañero de algunas asignaturas del programa de Magíster, gracias manito. A mi profesor guía, Pola, por su apoyo y por creer en mi, así como su especial sencillez que permite entregar desinteresadamente apoyo y consejo..gracias. A la comisión evaluadora de esta tesis, Dr. Fernando Kawaguchi, Dr. Carlos González y Dr. Jaime Madariaga, por su constante apoyo y aportes con ideas interesantes, gracias. Al Centro de Diagnóstico Oncoinmunológico Limitada, administrador del Laboratorio de Citometría de flujo del Hospital del Trabajador Concepción, por su confianza y por permitirme usar sus instalaciones. A mi yunta (o llunta) Natalia, con la cual sufrimos codo a codo durante el primer año del programa. A mi amigo, Oscar Venegas, por su incondicional apoyo y constantes palabras de aliento, gracias A mis amigos y socios comerciales, sin cuyo apoyo no habría podido intentar esta aventura, gracias

7 vi A todos los docentes del Departamento de Microbiología que participaron directa o indirectamente en mi formación académica; particularmente, a Carlos González, Ángel Oñate, Gerardo González y Miguel Martínez por todos los conocimientos aportados. Especial agradecimiento al profesor Mario Henríquez, quién no sólo me entregó conocimientos, si no que me entregó experiencia, confianza, sabiduría y amistad. Al personal auxiliar del Departamento de Microbiología, que me tuvo paciencia y siempre mostraron muy buen voluntad para ayudarme, gracias A mis colegas y personal del Laboratorio Clínico del Hospital del Trabajador, quienes me permitían hacer mis siembras, traspasos e incubaciones en sus instalaciones, gracias Quizás cuántos son los que se me quedan afuera de estas palabras, ellos me sabrán disculpar por no mencionarlos, gracias a todos ellos

8 vii INDICE GENERAL Página Índice General Índice de Figuras Índice de Tablas Resumen Abstract vii xi xv xvi xx 1. INTRODUCCION Citometría de flujo Fundamentos básicos Presentación de datos y análisis Citometría de flujo en estudios microbiológicos Potencial de Membrana ( Ψ) Bases físico químicas del potencial de membrana Medición de Ψ usando micro electrodos Medición indirecta de Ψ en suspensiones celulares 12 usando ensayos de distribución Estimación de Ψ por citometría de flujo Compuestos para ensayos potenciométricos Viabilidad celular Definiciones y evaluación por citometría de flujo 18

9 viii 1.4. Helicobacter pylori Características microbiológicas Patogénesis de la infección por H. pylori Tratamiento de la infección por H. pylori Hipótesis MATERIALES Y METODOS Reactivos Cepas bacterianas Condiciones de cultivo Preparación de suspensiones celulares para evaluación 31 de patrones de tamaño bacteriano por citometría de flujo 2.5. Preparación de controles negativos para viabilidad 32 celular, Ψ y eflujo bacteriano a bromuro de etidio Preparación de células muertas por calor Preparación de células muertas por shock frío Ensayo de viabilidad bacteriana por citometría de flujo Ensayo de Ψ por citometría de flujo Ensayo de eflujo bacteriano a bromuro de etidio por 34 citometría de flujo 2.9. Citometría de flujo Análisis de patrones de tamaño 35

10 ix Análisis de viabilidad bacteriana Análisis de Ψ y cálculo de razón de fluorescencia 38 roja/verde Análisis de eflujo bacteriano a bromuro de etidio RESULTADOS Determinación de calibración base Análisis de patrones de tamaño Ensayo de viabilidad celular en E. coli y S. aureus Ensayo de Ψ en E. coli y S. aureus Ensayo de viabilidad celular en Helicobacter pylori: Ensayo de Ψ en H. pylori Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en E. coli y S. 70 aureus 3.8. Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en H. pylori Acción de CCCP sobre la viabilidad celular, Ψ y el 73 probable eflujo de bromuro de etidio en S. aureus Acción de CCCP, valinomicina, azida de sodio y 74 MC , sobre la viabilidad celular, el potencial de membrana y el eflujo de bromuro de etidio en E. coli Acción de CCCP, valinomicina, azida de sodio y 77 MC , sobre H. pylori 4. DISCUSION 79

11 x 4.1. Citometría de flujo y bacterias Análisis de patrones de tamaño Ensayo de viabilidad celular en E. coli y S. aureus Ensayo de Ψ en E. coli y S. aureus Ensayo de viabilidad celular y Ψ en H. pylori Ensayo de eflujo a bromuro de etidio en E. coli y S. 89 aureus 4.7. Ensayo de eflujo a bromuro de etidio en H. pylori Ψ en H. pylori CONCLUSIONES PROYECCIONES GLOSARIO SOLUCIONES REFERENCIAS 110

12 xi INDICE DE FIGURAS Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 : Distintas formas gráficas de presentar los mismos datos. : Esquema de medición de medición de Ψ en eucariontes usando micro electrodos. : Selección de ventana de análisis en función de FSC y SSC. : Diagrama correspondiente a la secuencia de análisis de estimación de Ψ. Página Figura 5 : Selección de calibración base. 42 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 : Superposición de histogramas para la señal de FSC- H, representando distintos patrones de tamaño bacteriano. : Estimación de tamaño para E. coli K12 frente a diferentes antibióticos. : Patrón de tamaño de cepas de H. pylori después de incubación por 72 horas. : Viabilidad bacteriana, mediante la incorporación de PI. : E. coli. Bacterias vivas y bacterias muertas por calor. : Evaluación de linealidad, mediante incorporación de PI, en células de E. coli muertas por calor. : Células de S. aureus muertas por calor. Formación de agregados y el aumento de la destrucción celular. : Evaluación de linealidad, mediante incorporación de PI, en células de S. aureus muertas por calor

13 xii Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18 : Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la acción de diversas sustancias. : Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la acción de solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol. : Incorporación de PI en células de E. coli tratada por 30 minutos a 70ºC. : Incorporación de PI en células de S. aureus, bajo la acción de solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol. : Incorporación de PI en células de S. aureus, en diversas situaciones Figura 19 : Incorporación de PI en células de S. aureus sometidas a shock frío. 57 Figura 20 Figura 21 Figura 22 Figura 3 Figura 24 Figura 25 Figura 26 : Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a shock frío. : Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a shock frío. Ensayo triplicado. : Incorporación de PI en células de S. aureus sometidas a shock frío. Ensayo triplicado. : S. aureus y Ψ: Gráfico de FL2-H v/s FL1-H mostrando células polarizadas y depolarizadas : S. aureus: Histograma representando la razón FL2/FL1 en células depolarizadas y polarizadas. : Incorporación de PI en células de S. aureus muertas por shock frío. Evaluación de linealidad. : Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de Ψ (marcación con DiOC 2 (3)). Ensayo en triplicado Figura 27 : Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). 63

14 xiii Figura 28 Figura 29 Figura 30 Figura 31 Figura 32 Figura 33 Evaluación de linealidad de ensayo de Ψ (razón de fluorescencia roja/verde) en triplicado. : Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de estabilidad en el tiempo de ensayo de Ψ (marcación con DiOC 2 (3)). : Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de estabilidad en el tiempo de ensayo de Ψ ( razón de fluorescencia roja/verde). : E. coli. Incorporación de Dioc2(3), según el buffer usado. : Evaluación de linealidad en la Incorporación de PI de células de E. coli en PBS-EDTA. : Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de Ψ (marcación con DiOC 2 (3)). Ensayo en triplicado. : Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de Ψ ( razón de fluorescencia roja/verde). Ensayo en triplicado Figura 34 : H. pylori. Incorporación de PI (PBS-EDTA). 68 Figura 35 : H. pylori en PBS-EDTA. Evaluación de Ψ (marcación con DiOC 2 (3)). 69 Figura 36 Figura 37 Figura 38 : Eflujo a BrEt en E. coli. En A control positivo (células vivas) y en B control de negativo (células muertas). : E. coli (células vivas y muertas). Evaluación de linealidad para incorporación de PI y para eflujo a BrET. : S. aureus (células vivas y muertas). Evaluación de linealidad para incorporación de PI y para eflujo a BrET

15 xiv Figura 39 Figura 40 Figura 41 Figura 42 Figura 43 Figura 44 Figura 45 Figura 46 Figura 47 : Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre la viabilidad celular y el eflujo a BrEt. : Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre el Ψ (razón de fluorescencia roja/verde). : Células vivas de E. coli. Acción de diversos compuestos sobre la viabilidad celular. : Células vivas de E. coli. Acción de diversos compuestos sobre el eflujo a BrEt. : Células vivas de E. coli. Acción de diversos compuestos sobre la razón de fluorescencia roja/verde ( Ψ Ψ). : H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre incorporación de PI. : H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre el eflujo a BrEt. : H. pylori. Acción de diversos compuestos sobre la razón de fluorescencia roja/verde ( Ψ Ψ). : Relación entre Ψ, DIOC 2 (3), tamaño celular, formación de agregados y fluorescencias

16 xv INDICE DE TABLAS Tabla 1 : CMI para E. coli K12, frente a los antibióticos usados. Página 32 Tabla 2 : Protocolo básico de trabajo. 33 Tabla 3 Tabla 4 Tabla 5 : Patrones de estimación de tamaño definidos por el porcentaje de la gate para cada marcador. : Protocolo de cálculo de razón de fluorescencia roja sobre verde usando programa Flow Explorer 4.0. : Detalle de calibración base utilizada (Citómetro de flujo FACSCalibur) Tabla 6 : Patrones de tamaño de cepas control. 45 Tabla 7 : Patrones de tamaño de E. coli K12 bajo el efecto de diferentes antibióticos (a concentraciones de 0.5 y 2 veces la concentración mínima inhibitoria). 47 Tabla 8 : Patrones de tamaño para diferentes cepas de H. pylori después de un cultivo de 72 horas. 48

17 xvi RESUMEN El potencial de membrana ( Ψ Ψ) cumple un papel fundamental en la fisiología bacteriana. Como un componente de la fuerza protón motriz, se encuentra íntimamente involucrado en la generación de ATP. Además, participa en varios procesos como auto lisis bacteriana, transporte de glucosa, quimiotaxis y sobrevida a ph bajo. Los Ψ en bacterias metabólicamente activas son generados por diferencias en la concentración de iones en lados opuestos de la membrana celular. Esta diferencia de potencial es negativa en el interior de la membrana, variando entre 100 y 200 mv. Una disminución y un incremento en la magnitud del Ψ se conocen como depolarización eléctrica e hiperpolarización, respectivamente. El Ψ se reduce a cero, si la membrana es rota, la cual se vuelve permeable irreversiblemente a compuestos como el yoduro de propidio (PI), usados para estudios de viabilidad celular. Bajo este concepto, por un lado, el Ψ, y por otro, la impermeabilidad de la membrana a ciertas sustancias fluorescentes, se han usado como los principales indicadores del estado fisiológico de la membrana citoplasmática y de la viabilidad, respectivamente. El demostrar la captación de estos compuestos impermeables (PI, TO-PRO3 y Sytox Green) por células, es considerado un indicador de muerte celular. La medición de Ψ en bacterias en crecimiento activo, es esencialmente imposible, a raíz de su pequeño tamaño. Sin embargo, existen varios compuestos fluorescentes que se pueden usar para estimar el Ψ en bacterias. Los compuestos

18 xvii para ensayos potenciométricos, permiten efectuar mediciones de Ψ en organelos y en células que son muy pequeñas para permitir el uso de micro electrodos. En mediciones efectuadas por citometría de flujo, la intensidad de de la fluorescencia de estos compuestos es dependiente no sólo del Ψ, si no que también del tamaño celular. Considerando la importancia fisiológica del Ψ en bacterias, y la capacidad de H. pylori de sobrevivir en el estómago, al parecer, gracias a la generación de un potencial bioenergético sobre un amplio rango de acidez, se planteó como objetivos generales, determinar por citometría de flujo, los parámetros de tamaño, forma celular, viabilidad celular y potencial de membrana en bacterias y determinar el efecto que ejercen sobre el potencial de membrana y la viabilidad celular de H. pylori, diversas sustancias que tienen acción contra esta bacteria. De igual forma, se plantearon como hipótesis de trabajo, que «Usando citometría de flujo es posible estudiar los parámetros de tamaño y forma celular, potencial de membrana y viabilidad celular en Helicobacter pylori» y «Los diversos agentes antibacterianos utilizados en el tratamiento de la infección por Helicobacter pylori producen alteraciones en la células bacteriana, tanto de tamaño y morfología, como también en el potencial de membrana y viabilidad celular, parámetros determinables mediante citometría de flujo». Se desarrolló un método de análisis de patrones de tamaño bacteriano, basado en los datos de FSC correspondientes a diferentes tipos bacterianos

19 xviii (Acinetobacter ssp., Pseudomonas aeuruginosa, Escherichia coli y Bacillus subtillis), el cual se aplicó exitosamente en E. coli K12 bajo la acción de diversos antibióticos, así como también en cultivos de H. pylori. La determinación de viabilidad celular, mediante la incorporación de PI tanto en S. aureus y E. coli (previa permeabilización de la membrana externa con EDTA), así como la estimación de potencial de membrana usando DiOC 2 (3) (una carbocianina catiónica) se lograron implementar exitosamente mediante citometría de flujo. En el caso de H. pylori, no fue posible lograr la incorporación de PI en células muertas, ni tampoco determinar células polarizadas. A fin de indagar en la posibilidad de que la presencia de un sistema de eflujo impidiera la incorporación de PI y el ingreso de DiOC 2 (3) al interior de células polarizadas, se implementó exitosamente la medición de eflujo a bromuro de etidio (BrEt), tanto en E. coli, como en S. aureus. En H. pylori, no fue posible evaluar la presencia de eflujo a BrEt, así como también el uso de inhibidores metabólicos e inhibidores de sistemas de eflujo (CCCP, azida de sodio, valinomicina y MC ) sobre la incorporación de PI y la estimación de Ψ. En el caso particular de H. pylori, junto con considerar la naturaleza sorprendente de esta bacteria, se debe considerar la posibilidad de que tenga un potencial de membrana positivo o que éste se encuentre íntimamente regulado por el medio y ph del mismo. Se concluye que la evaluación por citometría de flujo de viabilidad celular en E. coli y S. aureus, puede ser definida por la determinación conjunta de tamaño

20 xix y forma celular, potencial de membrana, incorporación de PI y eflujo a BrEt. Lo anterior tienen una potencial aplicación en el estudio del efecto que diversas sustancias puedan ejercer sobre E. coli y S. aureus, aportando información adicional sobre la acción de éstas.

21 xx ABSTRACT The membrane potential ( Ψ Ψ) plays a fundamental role in the bacterial physiology. Like a component of the proton motive force, is intimately involved in the ATP generation. In addition, it participates in several processes like bacterial autolysis, glucose transport, Chemotaxis and survives at low ph. In metabolically active bacteria, Ψ are generated by differences in the concentration of ions in opposed sides of the cellular membrane. This difference of potential is negative inside the membrane, varying between -100 and -200 mv. A diminution and an increase in the magnitude of Ψ are known like electrical depolarization and hyper polarization, respectively. Ψ Is reduced to zero, if the membrane is broken, which irreversibly becomes permeable to compound like propidium iodide (PI), used for studies of cellular viability. On this way, the Ψ for one side and the impermeability of the membrane to certain fluorescent substances for the other side, has been used like the main indicators of the physiological state of the cytoplasmic membrane and the viability, respectively. Demonstrating the pick up of these impermeable probes (PI, To-pro3 and Sytox Green) by cells is considered an indicator of cellular death. The measurement of Ψ in active growing bacteria in, it is essentially impossible, as a result of his small size. Nevertheless, there are several fluorescent probes that can be used to estimate Ψ in bacteria. The potentiometric probes allow carrying out measurements of Ψ in organelles and cells that are very small to allow the use of microelectrodes. In measurements

22 xxi conducted by flow cytometry, the intensity of the fluorescence of these probes depends of the Ψ and of the cellular size. Considering the importance physiological of Ψ in bacteria, and the capacity of H. pylori to survive in the stomach, apparently, thanks to the generation of a bioenergetics potential on an ample rank of acidity, considered like general missions, to determine by flow cytometry, the size parameters, cellular forms, cellular viability and membrane potential in bacteria and to determine the effect of diverse substances upon the membrane potential and the cellular viability of H. pylori. Indeed the work hypothesis raised said "In Helicobacter pylori, using flow cytometry, is possible to study the size parameters and cellular forms, membrane potential and cellular viability" and "the diverse bacteriological agents used in the treatment of the infection by Helicobacter pylori, produce alterations in the cells bacterial, as much of size and morphology, like also in the potential of membrane and cellular viability, parameters that are determinable by flow cytometry". A method of analysis of patterns of bacterial size was developed, based on the FSC data corresponding to different bacterial types (Acinetobacter ssp., Pseudomonas aeuruginosa, Escherichia coli and Bacillus subtillis), which were applied successful in E. coli K12 under the antibiotic action diverse, as well as in cultures of H. pylori. The determination of cellular viability, by the incorporation of PI in S. aureus and E. coli (previous permebilization of the external membrane with EDTA), as well as the estimation of membrane potential

23 xxii using DiOC 2 (3) (a cationic carbocianine) were implement successful by flow cytometry. In the case of H. pylori, was not possible to obtain the incorporation of PI in died cells, and to either determine polarized cells. In order to investigate the possibility that the presence of an efflux system prevented the incorporation of PI and the entrance of DiOC 2 (3) to the interior of polarized cells, it was successful implemented the measurement of BrEt efflux in E. coli and S. aureus. In H. pylori, was not possible to evaluate the presence of BrEt efflux, as well as the metabolic and efflux system inhibitors (CCCP, sodium azide, valinomicin and MC 207,110) on the incorporation of PI and the estimation of Ψ. In the particular case of H. pylori, indeed with to consider the surprising nature of this bacterium, it must be considered the possibility that it has a positive membrane potential or that this is intimately regulated by environment and ph itself. It is concluded that the flow cytometric evaluation of cellular viability in E coli and S. aureus, can be defined by the integrated determination of size and forms cellular, membrane potential, incorporation of PI and BrEt efflux. This has a potential application in the study of the effect that diverse substances can exert on E coli and S. aureus, contributing additional information on the action on these molecules.

24 1 1. INTRODUCCION 1.1 Citometría de flujo Fundamentos básicos. La citometría de flujo permite evaluar características físicas y químicas de células en suspensión. Entrega información sobre el tamaño celular, la granularidad o complejidad interna, así como también de la intensidad de fluorescencia relativa que poseen las células en estudio. Esta tecnología hace posible medir los más diversos parámetros celulares como antígenos de superficie, citoplasmáticos y nucleares, contenido de ácidos nucleicos, actividad enzimática, flujo de calcio, potencial de membrana ( Ψ) y ph entre otros (Bono y col., 1998; Castillo y col, 1999; Castillo, 2005). El principio básico de la citometría de flujo, es la interacción de una fuente de luz, específicamente un rayo láser, con células en suspensión, las cuales son canalizadas e "interrogadas" individualmente por el láser, recogiéndose la información obtenida de dicha interacción. De este modo, es posible la medición de un gran número de células, en forma individual, en un período muy corto de tiempo mientras se desplazan en un sistema de flujo o torrente líquido ( células por segundo, en sangre periférica u otros líquidos corporales). Cada célula pasa por un punto donde son impactadas por un láser que emite fluorescencia a

25 2 una longitud onda dependiente de cada tipo de láser, y cuya luz es desviada o alterada de acuerdo a características propias de cada célula. La variación de la longitud de onda así producida, es captada y depurada por un complejo sistema de lentes y espejos especiales, que concentra esta luz y la transforma en pulsos de voltaje. Estos son codificados e interpretados por un computador provisto del programa adecuado. Los datos obtenidos de esta manera pueden manejarse muy versátilmente, siendo de gran confiabilidad y exactitud. Existen equipos que cuentan con uno, dos o más rayos láser, siendo lo común, la presencia de un láser que emite a 488 nm (láser de argón) (Castillo, 2005). La interacción de una célula con la luz del láser (ligth scatering), puede producir la desviación de esta última, en un ángulo menor a 10 grados, lo que se conoce como dispersión frontal o FSC (forward scatter) y su vez la desviación de la luz en más de 10 grados, pero en menos de 90, se conoce como dispersión lateral o SSC (side scatter). Es así como FSC y SSC son parámetros intrínsecos a la célula. Si a la suspensión celular se agrega un fluorocromo que tenga afinidad por algún componente celular y que además este fluorocromo sea excitable con el rayo láser en uso, se podrá detectar un cambio en la longitud de onda de emisión del fluorocromo; lo anterior se traducirá en formación de rangos o canales de fluorescencia, la cual es posteriormente detectada, facilitando la identificación de subgrupos específicos dentro de las grandes poblaciones celulares (Bono y col., 1998; Castillo y col, 1999; Castillo, 2005). Estas moléculas fluorescentes pueden estar acopladas a anticuerpos monoclonales específicos o en solución. Por

26 3 ejemplo, la fluoresceína, fluorocromo ampliamente usado tanto en microscopía de fluorescencia como en citometría de flujo, tiene una excitación máxima a 490 nm, siendo su emisión máxima a 520 nm. En los citómetros de flujo actuales, con aplicación en clínica, es posible detectar simultáneamente desde 1 hasta 12 rangos o canales de fluorescencia, lógicamente usando fluorocromos que emitan en diferente longitud de onda. Dado que ciertos fluorocromos se pueden unir a proteínas, es posible disponer anticuerpos conjugados con diversos fluorocromos. Si a esto se le suma el explosivo desarrollo de la producción y comercialización de anticuerpos monoclonales, conjugados con diversos fluorocromos, las potencialidades son enormes. Es así como hoy se dispone de anticuerpos contra una infinidad de moléculas biológicas, lo que se ha traducido en un gran desarrollo de los estudios de caracterización inmunofenotípica de diversos tipos celulares, muchos de ellos con una aplicación clínica concreta (Castillo, 2005) Presentación de datos y análisis. Un citómetro de flujo, a pesar de tener un sistema de fluidos, un sistema óptico y un sistema electrónico, es un equipo controlado informáticamente, existiendo para ello, diversas plataformas (PC y Macintosh principalmente), las cuales, mediante los programas adecuados permiten tanto la adquisición como el análisis de los datos obtenidos.

27 4 La acción de evaluar una suspensión de células en un citómetro de flujo, se llama adquisición (se adquiere la información de un determinado número de células en un tiempo determinado). Una vez adquirida la información sobre una suspensión celular, esta se almacena como un archivo, y éste es posible visualizarlo de diversas formas, dependiendo del programa de análisis que se use. Es así como los datos se pueden visualizar como gráficos de puntos, contorno, densidad, histogramas, tridimensional, etc., obteniéndose, en cada caso información numérica como por ejemplo coeficiente de variación, media de intensidad de fluorescencia, mediana, media geométrica, etc. (Figura 1) (Castillo, 2005). Un concepto fundamental al efectuar un análisis es la correcta selección de la región de interés a estudiar, la que se conoce como gate o ventana de análisis. Por ejemplo, si se han analizado bacterias, es posible acotar aún más el análisis, al seleccionar la población de bacterias, y así eliminar partículas de similar tamaño que puedan interferir con el análisis, para lo cual se dibuja una gate. Posteriormente, se puede obtener información específica sólo de la región seleccionada (Figura 3). Es posible combinar varias de estas regiones al momento de hacer un análisis, lo que se traduce en una gran capacidad y versatilidad en el manejo de la información (Castillo, 2005).

28 5 FIGURA 1: Distintas formas de presentar los mismos datos: SSC (granularidad) y CD45 (antígeno leucocitario común). (A) Gráfico de puntos; (B) gráfico de densidad; (C) gráfico tridimensional; (D) gráfico de contorno; (E) histograma que representa sólo SSC. (Adaptado con autorización de: Hematología: Fisiopatología y Diagnóstico. Palomo I., Pereira J. y Palma J. Editorial Universidad de Talca) Citometría de flujo en estudios microbiológicos. La citometría de flujo permite la medición de diversas características físicas y químicas a células individuales en suspensión, en microsegundos, proporcionando así una indicación de la heterogeneidad de una población de células eucarióticas o procarióticas en cuestión de minutos (Álvarez-Barrientos y col., 2000; Davey y col., 1996; Novo y col., 1999, 2000; Shapiro, 1997, 2000, 2001, 2003).

29 6 La detección directa de microorganismos por citometría de flujo, ya sean bacterias, hongos, parásitos y virus, tanto en sus parámetros intrínsecos (FSC y SSC) como en sus características químicas, ha sido objeto de diversos estudios (Álvarez-Barrientos y col., 2000; Davey y col., 1996). Es así como la detección directa de bacterias, usando anticuerpos conjugados con diversos fluorocromos, ha permitido la identificación rápida de diversos patógenos, como por ejemplo Haemophilus spp., Salmonella spp., Mycobacerium spp., Brucella spp., Branhamella catarrhalis, Mycoplasma pneumoniae, Pseudomona spp., Bacteroides fragilis, Legionella pneumophila, Bacillus spp, S. aureus y E. coli, entre otros (Álvarez-Barrientos y col., 2000; Bhushan y col., 1997; Bowden y col., 1995; Davey y col., 1996; Ozanne y col, 1996), con la ventaja de que es un ensayo que no necesita cultivo y además es rápido, comparado con el tiempo que toma un cultivo tradicional. De igual forma, se ha descrito la detección directa de hongos y levaduras, como por ejemplo la serotipificación de Candida spp. (Davey y col., 1996, Mercure y col., 1996), incluso demostrándose la etiología mixta de onicomicosis (Álvarez-Barrientos y col., 2000). La detección directa de parásitos, también ha permitido analizar rápidamente un gran número de muestras y con alta sensibilidad, en casos de giardiasis, así como también detectar antígenos de Plasmodium spp., en eritrocitos y evaluar la viabilidad de este parásito una vez fagocitado (Álvarez-Barrientos y col., 2000). La detección directa de virus, en células eucariontes infectadas, ha permitido la detección y cuantificación de antígenos y ácidos nucleicos virales, en diversas patología infecciosas, como por

30 7 ejemplo VIH, citomegalovirus, Herpes, Hepatitis B y C, entre otros (Álvarez- Barrientos y col., 2000; Davey y col., 1996). Aunque diversos investigadores han usado citometría de flujo para estudiar las interacciones de bacterias y agentes antibacterianos, la literatura internacional se ha centrado, principalmente, en el desarrollo de ensayos rápidos para la determinación de susceptibilidad antimicrobiana. (Davey y col., 1996; Jepras y col., 1997; Mason y col., 1995; Mortimer y col., 2000; Suller y col., 1998; Wickens y col., 2000). Es así como, a partir de las primeras pruebas de susceptibilidad por citometría de flujo, que datan de 1980, durante la década del 90 se produjo un considerable aumento de los informes internacionales, sobre la respuesta microbiana frente a diversos compuestos antimicrobianos. La gran ventaja de estos estudios, es que en pocas horas, se pueden evaluar poblaciones microbianas, tanto desde el punto de vista de individual y poblacional, así como también sus capacidades funcionales, es decir vías metabólicas, potencial de membrana, acumulación y utilización de polihidroxibutirato, entre otros (Álvarez- Barrientos y col., 2000; Davey y col., 1996). De este modo, dentro de los parámetros metabólicos posibles de evaluar por citometría de flujo, los estudios de tamaño celular, potencial de membrana y viabilidad celular, sin duda serán fundamentales y proporcionarán valiosa información para entender el efecto de nuevos agentes antibacterianos.

31 Potencial de Membrana ( Ψ) Bases físico químicas del potencial de membrana. En la mayoría de las células eucariotas y procariotas, existen diferencias de potencial eléctrico a través de sus membranas y también entre el citosol y el interior de organelos como cloroplastos y mitocondrias. Estas diferencias de potencial se deben, en parte, a la existencia de gradientes de concentración de iones Na +, K +, H + y Cl - a través de la membrana celular y en parte, a la presencia de varias bombas electrógenas. En células de mamíferos en reposo, la diferencia de potencial a través de la membrana citoplasmática tiene un rango de magnitud de 10 a 90 mv, siendo el interior negativo, respecto del exterior. Existe además una diferencia de potencial de 100mV o más, a través de la membrana de mitocondrias energizadas, con el interior negativo respecto del exterior. Este Ψ desaparece cuando el metabolismo energético desaparece. En células procariotas, las diferencias de potencial a través de estas membranas dependen del metabolismo energético, variando entre 100 y 200 mv. Por convención, un Ψ negativo en el interior se expresa como un número negativo, después de una hiperpolarización de la membrana, lo cual se define

32 9 como un incremento en la magnitud del potencial de membrana, y cuyo valor es típicamente menor que antes. Los resultados de la depolarización eléctrica de la membrana pueden ser más complejos. Mientras que en la mayoría de las situaciones, la depolarización de una bacteria es completa cuando el Ψ llega a cero, en el caso de células nerviosas y musculares, el interior se vuelve transitoriamente positivo con respecto al exterior. Las bacterias aeróbicas, generan un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana interna, lo que se conoce como la fuerza protón motriz. Este gradiente se logra gracias a oxidoreductasas orientadas a través de la membrana bacteriana, de modo tal que los protones son exportados y los electrones son ingresados, generándose de esta manera tanto un gradiente de protones, como un gradiente eléctrico, el Ψ (Sach y col., 1996). El Ψ cumple un papel fundamental en la fisiología bacteriana. Como un componente de la fuerza protón motriz, se encuentra íntimamente involucrado en la generación de ATP (Dimroth y col. 2000). Además, participa en varios procesos, como por ejemplo, autólisis bacteriana, transporte de glucosa, quimiotaxis y sobrevida a ph bajo (Novo y col., 1999, 2000; Shapiro, 1997, 2000, 2001, 2003). De esta manera, en las bacterias, el Ψ, refleja tanto el estado del metabolismo energético como la integridad física de la membrana citoplasmática. Organismos neutrófilos, como Escherichia coli, mantienen una fuerza protón motriz constante, ajustando la diferencia de potencial a través de la

33 10 membrana para compensar los cambios del gradiente de ph (Sach y col., 1996). Los Ψ en bacterias metabólicamente activas son generados por diferencias en la concentración de iones en lados opuestos de la membrana celular. Esta diferencia de potencial es negativa en el interior de la membrana, y varia entre 100 y 200 mv (Novo y col.,1999, 2000; Sach y col., 1996; Shapiro, 1997, 2000, 2001, 2003). Una disminución en la magnitud del Ψ se conoce como depolarización eléctrica. A su vez, un incremento en la magnitud del Ψ, se refiere como hiperpolarización. El Ψ se reduce a cero, si la membrana es rota, como es el caso del desarrollo de agujeros lo suficientemente grandes como para permitir que iones inorgánicos crucen libremente; por ejemplo, en células muertas por calentamiento, congelamiento, tratamientos químicos (concentraciones de aldehídos o alcoholes que actúen como fijadores) y ciertas clases de drogas antibacterianas, fundamentalmente antibióticos beta lactámicos. El Ψ en reposo a través de la membrana citoplasmática se estima frecuentemente a partir de la ecuación de Goldman:

34 11 Ψ : Potencial de membrana R : Constante de gas T : Temperatura en grados Kelvin F : Faraday [X] i : Concentración de iones X dentro de la célula [K + ] o : Concentración de iones X fuera de la célula P x : Permeabilidad de la membrana a iones X Medición de Ψ usando micro electrodos El Ψ se puede medir directamente usando micro electrodos implantados, técnica muy difícil de aplicar a células pequeñas. Sin embargo, con estas mediciones directas se ha logrado detectar cambios en el potencial de membrana en respuesta a interacciones ligando receptor, así como también durante el impulso nervioso. En las células de gran tamaño, el potencial a través de la membrana plasmática se puede medir con un micro electrodo insertado dentro de la célula y que se construye mediante el llenado de un tubo de vidrio de diámetro muy pequeño con un líquido conductor (por ejemplo KCl), de manera tal que la membrana de superficie se selle alrededor del electrodo. Además se coloca un electrodo de referencia en el líquido extracelular. Ambos electrodos se conectan con un voltímetro capaz de medir pequeñas diferencias de potencial.

35 12 Figura 2: Esquema de medición de medición de Ψ en eucariontes usando micro electrodos Medición indirecta de Ψ en suspensiones celulares usando ensayos de distribución. La estimación indirecta de Ψ se puede obtener monitoreando la distribución de indicadores catiónicos lipofílicos radiomarcados (3Htriphenylmethylphosphonium) o fluorocromos catiónicos lipofílicos, como cianinas y safraninas. Los indicadores lipofilícos son usados porque pueden pasar libremente la porción lipídica de la membrana.

36 13 Una depolarización de las células provocará la liberación del indicador de las células al medio, mientras que una hiperpolarización hará que ingrese el indicador desde el medio. La distribución del indicador no representará adecuadamente el nuevo valor de Ψ hasta que se logre un equilibrio. Este proceso requiere de períodos de tiempo que van desde unos pocos segundos a varios minutos. Es así como, mientras los ensayos de distribución son adecuados para la detección de cambios lentos en el Ψ, no se pueden usar para monitorear cambios rápidos que ocurren durante la propagación de potenciales de acción en tejidos como el nervioso y muscular. El uso de fluorocromos catiónicos lipofílicos es una alternativa un poco menos compleja que el uso de cationes lipofílicos radiomarcados. Este úlitmo método requiere que un mínimo volumen conocido de células (u organelos) en suspensión esté en equilibrio con el indicador, para luego calcular la cantidad de indicador unido a la célula mediante un contador de centelleo. La adición de células a soluciones micromolares de fluorocromos, como por ejemplo DiOC 6 (3) (3,3 dihexyloxacarbocianina), produce una suspensión con una fluorescencia menor que la solución original, indicando que a concentraciones externas micromolares, la fluorescencia del fluorocromo captado por las células disminuye. La estimación de Ψ de células en suspensión usando cianinas se realiza en un espectrofluorómetro.

37 14 Sin embargo, estas técnicas proporcionan un valor promedio de Ψ de la suspensión celular completa, y no proporcionan información de variaciones de Ψ célula a célula, dentro de poblaciones celulares (Novo y col., 1999, 2000; Shapiro, 2000, 2001, 2003), siendo el interés de estas observaciones, las que estimularon el desarrollo de técnicas que utilizaran la citometría de flujo para estimar Ψ Estimación de Ψ por citometría de flujo La estimación de Ψ en células eucariotas y bacterianas individuales, por citometría de flujo, usando fluorocromos, se ha efectuado por más de 20 años. El primer informe de la medición de Ψ usando citometría de flujo data de 1979, cuando Howard Shapiro empleó cianinas y oxonoles, fluorocromos usados originalmente para mediciones volumétricas con espectrofluorometría (Shapiro y col., 1979). Sólo recientemente, la disponibilidad metodológica ha permitido determinaciones más precisas en términos de medias poblacionales, heterogeneidad poblacional y detección de cambios en el tiempo Compuestos para ensayos potenciométricos. Existen varios compuestos fluorescentes que se pueden usar para estimar el Ψ en bacterias. Compuestos fluorescentes del tipo cianinas, junto con otros compuestos lipofílicos que tienen una carga positiva, como la rodamina 123, y que

38 15 añadidos a suspensiones celulares, son concentrados en la bacteria, en respuesta al gradiente de Ψ negativo en el interior. De este modo, la fluorescencia de organismos expuestos a bajas concentraciones de estos compuestos, se incrementa con la hiperpolarización y disminuye con la depolarización (Novo y col., 1999, 2000; Rabinovitch, 1990; Shapiro, 1997, 2000, 2001, 2003). La mayoría de los fluorocromos ahora usados como pruebas para Ψ, fueron desarrollados durante la búsqueda sistemática hecha por Lawrence Cohen y colaboradores, en la Universidad de Yale, Estados Unidos (Cohen y col, 1978; Shapiro, 2003), para obtener materiales que exhibieran cambios rápidos, en sus propiedades ópticas, para responder a los potenciales de acción de células nerviosas. Muchos de los fluorocromos evaluados, se distribuían a través de membranas celulares, en respuesta a cambios de potencial lentos. La mayoría de estos fluorocromos catiónicos lipofílicos caen en esta categoría. Los compuestos para ensayos potenciométricos, permiten efectuar mediciones de Ψ en organelos y en células que son muy pequeñas para permitir el uso de micro electrodos. La selección del compuesto más adecuado para los fines a estudiar, puede ser complicada a raíz de variaciones substanciales en su respuesta óptica, fototoxicidad e interacciones con otras moléculas (Haugland, 2002; Shapiro, 1997, 2003). Los compuestos para ensayos potenciométricos se pueden dividir en dos grandes grupos, basándose en su mecanismo de respuesta: Compuestos de respuesta rápida (Fast response probes): Actúan por un cambio en su estructura electrónica, y en consecuencia en sus propiedades

39 16 fluorescentes, en respuesta a un cambio en el campo eléctrico del medio. Su respuesta óptica es lo suficientemente rápida para detectar cambios transitorios de potencial (milisegundos). Sin embargo, la magnitud del cambio de fluorescencia dependiente de potencial, es a menudo muy pequeña, mostrando un cambio de fluorescencia de 2 10 % por 100 mv (Haugland, 2002). Compuestos de respuesta lenta (Slow response probes): Muestran cambios dependientes de potencial en su distribución de transmembrana, que son acompañados de un cambio en la fluorescencia. La magnitud de su respuesta óptica es mucho más grande que los compuestos de respuesta rápida, mostrando un cambio de fluorescencia de 1% por mv. Este grupo incluye carbocianinas y rodaminas catiónicas y oxonoles aniónicos, siendo adecuados para detectar cambios en el Ψ promedio de células no excitables (Haugland, 2002). Dentro de las carbocianinas se pueden distinguir los derivados indo (DiI), thia (DiS) y oxa (DiO), los cuales son moléculas de entre uno a siete átomos de carbono. Son compuestos lipofílicos con una carga positiva localizada; su estructura presenta dos anillos heterocíclicos idénticos, unidos por un puente polimetilo (Haugland, 2002).

40 17 De acuerdo con la nomenclatura usada por primera vez por Sims y col., en 1974, estos compuestos pueden ser llamados DiYC n+1 (2m+1). Donde Y corresponde a los sustituyentes en el anillo: O : átomos de oxígeno S : átomos de azufre I : Grupo (C(CH 3 ) 2 ) La hidrofobicidad de estos compuestos, con valores idénticos de m e Y, aumenta con la longitud de la cadena lateral N-alkyl (aumentando n). Estos fluorocromos catiónicos se acumulan en membranas hiperpolarizadas y son translocados dentro de la bicapa lipídica (Haugland, 2002; Rabinovitch, 1990, Shapiro, 2003). En mediciones efectuadas por citometría de flujo, la intensidad de la fluorescencia de estos compuestos es dependiente no sólo del Ψ, si no que también del tamaño celular. Aprovechando estas características, Novo y col. (1999), desarrollaron un método para medir Ψ en bacterias usando citometría de flujo, basándose en la razón del aumento de emisión de fluorescencia roja de DiOC 2 (3) (3,3 -dietiloxacarbocianina iodada).

41 Viabilidad celular Definiciones y evaluación por citometría de flujo Por un lado, el Ψ, y por otro lado, la impermeabilidad de la membrana a ciertas sustancias fluorescentes, han sido usados como los principales indicadores del estado fisiológico de la membrana citoplasmática y de la viabilidad del microorganismo, respectivamente. Aunque células de diferentes especies, pueden exhibir diferencias en la permeabilidad de la membrana, se cree que ciertas clases de compuestos, incluyendo compuestos orgánicos que tienen al menos dos cargas positivas y compuestos orgánicos cargados negativamente, son excluidos por membranas celulares intactas, tanto de bacterias como de eucariontes (Guindulain y col., 2002; López-Amorós y col., 1997; Novo y col., 2000; Shapiro, 2001, 2003; Vives-Rego y col., 2000.). El demostrar la captación de estos compuestos impermeables por células, es considerado un indicador de muerte celular. Los colorantes que pueden entrar y teñir células vivas, han sido descritos como colorantes vitales, aún cuando la mayoría de ellos son tóxicos para la célula. Existe un problema semántico en lo que se refiere a definir viabilidad celular. Generalmente se considera clonogenicidad o viabilidad reproductiva como sinónimo de viabilidad celular. Lo anterior presenta dos notables desventajas:

42 19 1. La definición de viabilidad en términos de capacidad reproductiva, excluye a células completamente diferenciadas y funcionales como es el caso de células nerviosas y musculares en el caso de eucariontes y a células vegetativas, en el caso de procariontes. En esta situación, la preservación de alguna función celular específica sería más acorde con el criterio de viabilidad. 2. Mientras que la reproducción celular en cultivo proporciona una evidencia inequívoca de viabilidad, la falla en reproducir células se puede deber a una falla en la metodología usada más que a un daño celular. Howard Shapiro (2003), propone usar el término células intactas, para describir a células que no han sido tratadas con fijadores o agentes lizantes, y que no muestran una alteración morfológica y funcional. Entre los parámetros considerados como característicos de células intactas, se encuentran: la integridad de la membrana, la permeabilidad y fluidez de la membrana, el Ψ y el ph. Para poder teñir o marcar constituyentes no localizados en la superficie de células intactas, un colorante o fluorocromo debe ser capaz de cruzar la membrana celular, ya sea por difusión o por alguna forma de transporte activo. La mayoría de los colorantes descritos como tinciones vitales, son pequeñas moléculas que son relativamente solubles en lípidos y son, ya sea, cargadas positivamente o eléctricamente neutras a ph fisiológico. Una alta solubilidad en lípidos favorece el paso desde un medio acuoso a la fase lipídica de la bicapa de la membrana

43 20 celular. Compuestos orgánicos conteniendo al menos dos cargas positivas (DAPI, PI, TO-PRO-1), son impermeables a las membranas intactas. El Bromuro de etidio (BrEt), comparte la estructura de anillo heterocíclico del ioduro de propidium (PI), pero sólo presenta una sola carga positiva. Ambos fluorocromos forman complejos con ADN y ARN, y son tóxicos para las células, una vez que son internalizados. Sin embargo el BrEt, entra normalmente en la célula y es expulsado al exterior por algunas bacterias, mientras que el PI es excluido por su carga positiva adicional Helicobacter pylori Por muchos años, se pensó que la presencia de secreción ácida en el estómago no sólo ayudaba al proceso de digestión, sino que también actuaba como una barrera para infecciones bacterianas. El aislamiento de Helicobacter pylori en el estómago, al menos en parte, refutó esa idea. H. pylori es un patógeno gastroduodenal humano, cuyo hábitat es la mucosa gástrica (Blaser y col., 1992, 1994). Se le considera uno de los factores etiológicos fundamentales de la enfermedad péptica ulcerosa, siendo también agente etiológico importante de la dispepsia no ulcerosa, de gastritis superficial crónica (denominada también gastritis tipo B) y linfoma MALT. Específicamente coloniza y produce la inflamación del antro del estómago (Blazer y col, 1992) y, desde 1994, la IARC (grupo de estudio del cáncer, O.M.S., 1994) lo ha incluido entre los agentes

44 21 carcinógenos tipo 1, constituyéndose así en una de las especies bacterianas de mayor interés en patología humana (De Fuigereido y col., 1998) Características microbiológicas Esta bacteria tiene morfología heterogénea. Puede presentarse en forma helicoidal, espiralada o curva, con 2 a 6 flagelos lofótricos cubiertos por una vaina; sin embargo, en cultivos envejecidos tiende a presentar forma cocoide. Mide 0.5 a 1.0 µm de diámetro por 2.5 a 5.0 µm de longitud (Geis y col., 1989; Goodwin y col., 1993). Las colonias son no pigmentadas, translúcidas y de 1 a 2 mm de diámetro. Entre sus características metabólicas destaca la producción de una potente ureasa, con una actividad cercana al doble de la ureasa de Proteus mirabilis (Mobley y col., 1988). Esta alta tasa hidrolítica, es muy importante para la colonización de la mucosa gástrica (Hazell y col., 1986), pues en presencia de urea forma amonio que neutraliza los iones hidrógeno que rodean la bacteria lo que permite su sobre vivencia en el jugo gástrico (McNulty y col., 1987; Megraud y col., 1989). Es además, catalasa y oxidasa positivo. Desde el punto de vista de su metabolismo respiratorio, la especie es microaerofílica, es decir, requiere una atmósfera con 5% de O2 y 5 a 10% de CO2. Su temperatura óptima de crecimiento es 37ºC, pero puede crecer a 30ºC, aunque no a 25ºC (Goodwin y col., 1986). El crecimiento se manifiesta entre el 2º y 5º día de incubación. Los medios

45 22 de cultivo deben ser suplementados con sangre, suero de bovino fetal, carbón activado, almidón de maíz o hemina (Buck y col., 1987; Kehler y col., 1994). H. pylori, tiene un ph óptimo de crecimiento in Vitro (en ausencia de urea) entre ph 6.0 y ph 7.0 y no crece a ph menores a 4.5 o sobre 8.0, por lo que considerando esta información, presenta características correspondientes a una bacteria neutrófila (Sach y col., 1996) Patogénesis de la infección por H. pylori H. pylori accede al epitelio gastrointestinal pasando a través del moco y la mucosa gástrica gracias a su morfología espiral y a la presencia de los flagelos. Penetra la capa mucosa hasta quedar en contacto con las células secretoras de mucus, donde se asocia a los receptores de superficie celular para formar pedestales de adhesión. En este ambiente, encuentra un nicho ideal para desarrollarse, pues obtiene todos los nutrientes necesarios y mantiene un ph neutro producto de la secreción de bicarbonato realizada por las células más internas del epitelio gástrico y la pared mucosa a diferencia de otras bacterias (Axón, 1993) Tratamiento de la infección por H. pylori En la actualidad, uno de los mayores desafíos clínicos que presenta H. pylori se relaciona con la toma de decisión en cuanto a cuándo realizar un

46 23 tratamiento de erradicación y cómo efectuarlo y pese a que las indicaciones para el tratamiento se han expandido, aún no existe un acuerdo en relación con la terapia óptima (Well y col., 1996), aunque existe consenso del beneficio de la erradicación de H. pylori en todo paciente con úlcera péptica documentada (NIH Consensus Conference, 1994.). La erradicación de H. pylori no es simple y se requiere la administración de varias drogas en conjunto, incluyendo antibióticos e inhibidores de la bomba de protones. Existen numerosos esquemas de tratamiento, que incluyen neutralización del ph ácido en el interior del estómago y protección de la mucosa. La neutralización del ph ácido se realizaba inicialmente con bicarbonato, pero en la década del 70 se introdujeron en la terapia, los antagonistas de protones, que reducen la secreción de ácido bloqueando los receptores que permiten a la histamina estimular a las células productoras de ácido (Goodwin y col., 1986; Rauws y col., 1988). En la actualidad, se cuenta con fármacos, como por ejemplo el Omeprazol, que bloquean la bomba de protones. Estos fármacos tienen mayor eficacia en inhibir la producción de ácido y lo hacen en menor tiempo (Wood y col., 1995). No obstante que estos últimos fármacos han mejorado los resultados de la terapia, en muchos pacientes reaparece la úlcera a los pocos meses de finalizado el tratamiento y los cuadros se pueden presentar con mayor intensidad e incluso las recaídas pueden manifestarse sin sintomatología previa acompañada de hemorragia o perforación. Los actuales esquemas de tratamiento varían ampliamente, entre una terapia dual de 14 días hasta terapias triples o cuádruples de 7 a 10 días. Los tratamientos utilizados incluyen inhibidores de la bomba de protones (omeprazol, lansoprazol,

47 24 pantoprazol, rabeprazol), antagonistas de los receptores H2 (ranitidina, famotidina, cimetidina) y antibacterianos como sales de bismuto, beta lactámicos (amoxicilina), macrólidos (azitromicina, claritromicina y roxitromicina), nitroimidazoles (metronidazol, tinidazol) o tetraciclina (González, y col., 2001).

48 Hipótesis No está claro, por qué H. pylori coloniza el estómago y que propiedades especiales posee esta bacteria, que le permiten desenvolverse en un medio ácido hostil. Esta propiedades, parecen ser muchas, siendo la principal, la capacidad de resistir al menos en parte, cierto grado de acidez, en una forma más eficiente que una bacteria aeróbica como E. coli. Bajo estas condiciones, el ajuste de las características bioenergéticas de H. pylori frente a un medio ácido o alcalino, tendría un papel importante en la capacidad de la bacteria para sobrevivir en el estómago (Matin y col., 1996; Sach y col., 1996). En este contexto, la generación de un potencial bioenergético sobre un rango amplio de acidez y en especial el potencial de membrana de H. pylori, serían factores fundamentales en la viabilidad, crecimiento y proliferación en un medio adverso, así como el efecto que sobre dicho potencial puedan ejercen diversos compuestos con acción contra H. pylori. Por lo anterior, el desarrollar un protocolo para evaluar el potencial de membrana en poblaciones bacterianas, toma un destacado papel en la comprensión de los mecanismos fisiopatológicos de la infección por H. pylori, así como en su terapia. Al respecto, y considerando la disposición de un citómetro de flujo en nuestra ciudad, se plantearon las siguientes hipótesis de trabajo:

49 26 1. «Mediante citometría de flujo, es posible determinar los parámetros de tamaño, forma celular, potencial de membrana y viabilidad celular en Helicobacter pylori.» 2. «Los diversos agentes antibacterianos utilizados en el tratamiento de la infección por Helicobacter pylori, producen alteraciones en la células bacteriana, tanto de tamaño, morfología, como también en el potencial de membrana y viabilidad celular; parámetros determinables mediante citometría de flujo.» Estas hipótesis se sustentan en los antecedentes previamente descritos en diversos trabajos: Característica Estudiada Estimación de bio volumen bacteriano. Ψ en Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus. Autores Bouvier y col., 2001; Robertson y col., 1998, Shavalov y col., Novo y col., 1999, 2000; Shapiro, 1997, 2000, 2001, 2003; Wickens y col., Análisis monoparamétrico de poblaciones celulares por Carbonari M.2002; Lampariello y col., 1998; Watson, citometría de flujo. Marcación de ácidos nucleicos y Alberghina y col. 2000; Guindulain y

50 27 viabilidad celular, por citometría de flujo, en bacterias. col., 2002; López-Amorós y col., 1997; Mette y col., 1994; Steen y col., 1994, Estudios, por citometría de flujo, del efecto de antimicrobianos sobre bacterias. Jernaes y col., 1994; Jepras y col. 1997; Mortimer y col., 2000; Stten y col., 2000; Suller y col., 1997, 1998; Vives-Rego y col., 1997; Walberg y col., 1997, 1999; Wickens y col., Características bio energéticas de H. pylori. Matin y col, 1996; Sach y col., 1996; Scout y col., 1998; Stingl y col., 2001, Considerando por un lado, la capacidad de H. pylori de sobrevivir en el estómago, debido, entre otras razones, a la generación de un potencial bioenergético sobre un amplio rango de acidez, gracias a la síntesis y actividad de la enzima ureasa, cuya acción (hidrólisis de urea, y formación de (NH 4 ) 2 CO 3 ), es capaz de elevar el ph ácido en el medio ambiente cercano a la bacteria, hasta valores relativamente neutros (Matin A. y col., 1996; Sach G. y

51 28 col., 1996), y por otro lado la importancia fisiológica del Ψ en bacterias, se planteó como objetivos generales: 1. Determinar por citometría de flujo, los parámetros de tamaño, forma celular, viabilidad celular y potencial de membrana en bacterias. 2. Determinar el efecto que ejercen sobre el potencial de membrana y la viabilidad celular de H. pylori, diversas sustancias que tienen acción contra esta bacteria. Objetivos Específicos: 1. Determinar, mediante citometría de flujo, los parámetros de tamaño, forma, viabilidad celular y potencial de membrana, en E. coli y S. aureus. 2. Determinar, mediante citometría de flujo, los parámetros de tamaño, forma, viabilidad celular y potencial de membrana, en H. pylori. 3. Evaluar el efecto de agentes antibacterianos usados comúnmente en el tratamiento de erradicación de H. pylori, sobre el potencial de membrana y viabilidad celular de H. pylori.

52 29 2. MATERIALES Y METODOS 2.1. Reactivos: Yoduro de propidio (PI) : Sigma Chemical Co, Estados Unidos. Preparado en PBS, solución madre de 2 mg/ml. Conservado en oscuridad y a 4ºC. 3,3`-dietiloxacarbocianina iodada (DIOC 2 (3)) : Aldrich Chem. Co., Estados Unidos. Preparado en DMSO, solución madre de 1 mm. Conservado a -30ºC. Valinomicina : Sigma Chemical Co, Estados Unidos. Preparado en DMSO. Conservado en oscuridad y a 4ºC. Carbonyl cyanide m- chlorophenyl-hydrazone (CCCP). : Sigma Chemical Co, Estados Unidos. Preparado en DMSO. Conservado en oscuridad y a 4ºC. Bromuro de etidio (BrEt) : Sigma Chemical Co, Estados Unidos. Solución madre de 10 mg/ml. Conservado en oscuridad y a 4ºC.

53 Cepas bacterianas: Escherichia coli ATCC 25922, utilizada en los ensayos de viabilidad celular, eflujo a BrEt y estimación de potencial de membrana. Staphylococcus aureus ATCC 29213, utilizada en los ensayos de viabilidad celular, eflujo a BrEt y estimación de potencial de membrana. Helicobacter pylori ATTC 43504, usada en los ensayos de viabilidad celular, eflujo a BrEt y estimación de potencial de membrana. Escherichia coli K12, Pseudomona aeuruginosa, Acinetobacter spp. y Bacillus subtilis usados como referencia en los ensayos de estimación de tamaño bacteriano Condiciones de cultivo: Todas las cepas, a excepción de H. pylori fueron cultivadas en medio líquido (caldo Müller Hinton) filtrado (filtro con poros de 0.20 µm de diámetro) a 37ºC durante 18 horas. Escherichia coli K12 se usó para evaluar el efecto de algunos antibióticos sobre la forma y tamaño bacteriano. La CMI para ampicilina, gentamicina, tetraciclina y ceftazidima se determinó mediante dilución en caldo tripticasa de

54 31 soya filtrado (0.20 µm). La CMI se definió como la mínima concentración de antibiótico a la cual no hubo crecimiento a simple vista. En esta Tesis, también se utilizaron cepas de H. pylori aisladas de biopsias gástricas antrales, provenientes de pacientes sometidos a endoscopía digestiva alta (sin tratamiento antibiótico previo). Estas muestras fueron obtenidas en el Hospital del Trabajador de Concepción. Las biopsias gástricas se maceraron en suero glucosalino (NaCl 0.85 %, glucosa 1%) estéril hasta formar una suspensión homogénea. Se sembraron 100 µl de esta suspensión en agar Columbia con 5% de sangre de caballo, suplementado con un inhibidor selectivo de la flora bacteriana y fúngica (DENT: Oxoid, Hampshire, Inglaterra). Los cultivos se incubaron durante cuatro días a 37 C, en microaerofilia (5% de O 2 y 5-10% de CO 2 ) usando sistema generador de microaerofilia GasPak (Difco: Detroit, Estados Unidos). La identificación de las cepas se hizo en base a tinción de Gram modificada (con fucsina como colorante de contraste), prueba de ureasa y reacción de catalasa (Gonzalez C. y col., 2001) Preparación de suspensiones celulares para evaluación de patrones de tamaño bacteriano por citometría de flujo En el caso de E.coli K12, ésta se cultivó en medio líquido, en presencia de los antibióticos ampicilina, gentamicina, tetraciclina y ceftazidima a una concentración de 0.5 y 2 veces la CMI (Tabla 1). A partir de cada cultivo líquido,

55 32 se obtuvo un sedimento mediante centrifugación (800 g por 10 minutos), el cual se lavó con PBS, se resuspendió en 0.5 ml de PBS, para luego adquirir en el citómetro de flujo. En el caso de H. pylori, las bacterias fueron resuspendidas en 2.0 ml de PBS, a partir de placas incubadas en las condiciones adecuadas, lavadas y resuspendidas en 0.5 ml de PBS y así adquiridas en el citómetro de flujo. Tabla 1: CMI para E. coli K12, frente a los antibióticos usados. Antibiótico CMI 0.5 CMI 2 CMI Ampicilina 8 µg/ml 4 µg/ml 16 µg/ml Gentamicina 16 µg/ml 8 µg/ml 32 µg/ml Ceftazidima 0.5 µg/ml 0.25 µg/ml 1 µg/ml Tetraciclina 1 µg/ml 0.5 µg/ml 2 µg/ml 2.5. Preparación de controles negativos para viabilidad celular, Ψ y eflujo bacteriano a bromuro de etidio Preparación de células muertas por calor A partir de un cultivo líquido de 18 horas (E. coli y S. aureus) y de una emulsión en caldo MH (H. pylori), se tomaron 2.0 ml de medio conteniendo bacterias y se sometió a baño María por 10 minutos para luego dejar enfriar. Se centrifugó y luego se lavó el sedimento, para luego ser resuspendido en PBS.

56 Preparación de células muertas por shock frío A partir de un cultivo líquido de 18 horas (E. coli y S. aureus) y de una emulsión en caldo MH (H. pylori), se tomaron 1.0 ml de medio conteniendo bacterias, se procedió a lavar con PBS, centrifugar y el sedimento se resuspendió en 8.0 ml de etanol absoluto frío (conservado a -30ºC). Se incubó 1 hora a -30ºC, para luego centrifugar, eliminar el sobrenadante y lavar con PBS, y finalmente se resuspendió en PBS. Con el objetivo de poder discriminar claramente bacterias vivas de bacterias muertas, e incluso discriminar situaciones en que hubiera una mezcla de bacterias vivas y muertas, se utilizó un protocolo básico de preparación de suspensiones celulares (Tabla 2), el cual permitió la evaluación de una linealidad en cuanto a la presencia de bacterias vivas y/o muertas a diferentes puntos, siempre considerando 15 µl de bacterias (vivas o muertas) en 1.0 ml de PBS. La concentración de bacterias vivas o muertas se pudo así relacionar directamente con el inóculo del cultivo líquido usado. Tabla 2: Protocolo básico de trabajo. Tubo Bacterias vivas (µl) Bacterias muertas (µl)

57 Ensayo de viabilidad bacteriana por citometría de flujo. En 1.0 ml de PBS, se resuspendieron 15 µl de bacterias (vivas y/o muertas), luego se adicionaron 10 µl de yoduro de propidio (PI) a partir de una solución stock de 1 mg/ml en PBS (10 µg/ml concentración final). Luego de incubar por 5 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad, se adquiere en el citómetro de flujo Ensayo de Ψ por citometría de flujo. Tomando como base, el protocolo descrito por Novo y colaboradores en 1999, en 1.0 ml de buffer de marcación, se resuspendieron 15 µl de bacterias (vivas y/o muertas), luego se adicionaron 30 µl de 3, 3`-dietiloxacarbocianina iodada (DiOC 2 (3)) (30 µm concentración final), incubándose por 4 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Finalmente se adquirió en citómetro de flujo Ensayo de eflujo bacteriano a bromuro de etidio por citometría de flujo. Considerando el protocolo descrito por Mette y colaboradores (1994), se utilizó BrEt a fin de evaluar la presencia de un eflujo a este compuesto. A partir de

58 35 una solución madre de 10 mg/ml de BrEt se preparó una solución de trabajo de 1 mg/ml. Para el ensayo de eflujo, en un 1.0 ml de PBS se resuspendieron 15 µl de bacterias (vivas y/o muertas), se adicionaron 20 µl de BrEt (20 µg/ml concentración final), incubándose por 5 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Finalmente se adquirió en citómetro de flujo Citometría de flujo Los estudios citométricos se efectuaron en el Laboratorio de Citometría de Flujo del Hospital del Trabajador de Concepción (administrado por el Centro de Diagnóstico Oncoinmunológico Limitada). El citómetro de flujo utilizado es un FACSCalibur (Becton Dickinson), utilizando el programa de adquisición y análisis CELLQuest v 1.1. La velocidad del flujo utilizada fue de 12 µl/min, lo que se traduce en un máximo de eventos celulares por segundo. Se adquirió un total de eventos celulares Análisis de patrones de tamaño Se efectuó utilizando el programa de adquisición y análisis CELLQuest v 1.1. Se dibujó una ventana de análisis (gate), en función de FSC (Foward scatter o dispersión frontal) y SSC (side scatter o dispersión lateral), de modo que más del 90% de los eventos celulares estuvieran incluidos (Figura 3).

59 36 Figura 3: Selección de ventana de análisis en función de FSC y SSC. En función de FSC y SSC, se dibujó una ventana de análisis (R1), de modo que incluyera más del 90% de los eventos celulares (A). Posteriormente se analizaron los datos contenidos en esta región (histogramas B, C y D). Todos los datos se expresaron en forma de canales. Los valores de canales en el citómetro de flujo modelo FACSCalibur tienen un rango que va desde 0 hasta Cada histograma fue dividido por 8 marcadores consecutivos con un espacio de 100 canales cada uno. El primero de estos marcadores comprendía el rango de 300 +/- 50 canales. Se utilizó el porcentaje de la región de análisis para todos los datos.

60 37 Para evaluar el rango de tamaños celulares de las células detectadas en cada sección, se consideraron intervalos de FSC-H que contuvieran un número significativo de eventos celulares, relacionado con el porcentaje de la región de análisis dentro de cada marcador y el número de eventos celulares. Al considerar lo anterior con la definición arbitraria de células cocoides, bacilos cortos, bacilos y bacilos largos, se pudieron definir algunos patrones de tamaño (Tabla 3). Tabla 3: Patrones de estimación de tamaño definidos por el porcentaje de la gate para cada marcador. Marcador Rango de canales Patrón de estimación de tamaño Sugerente (% gate) Concordante (% gate) M Cocoide (C) 5 15 > 15 M Cocoide (C) 5 15 > 15 M Bacilo corto (BC) 5 15 > 15 M Bacilo corto (BC) 5 15 > 15 M Bacilo (B) 5 15 > 15 M Bacilo (B) 5 15 > 15 M Bacilo largo (BL) 5 15 > 15 M Bacilo largo (BL) 5 15 > 15 Un valor mayor de 15% se consideró en concordancia con el patrón dado para cada marcador. Un valor entre 5% y 15%, sugiere un patrón dado para cada marcador Análisis de viabilidad bacteriana. Utilizando el programa de adquisición y análisis CELLQuest v 1.1. se dibujó una ventana de análisis (gate) en función de FSC y SSC, de modo que más

61 38 del 90% de los eventos celulares estuvieran incluidos (Figura 3). Como control positivo, se utilizaron células viables, es decir células que no incorporaron PI y como control negativo, células muertas, es decir células que sí incorporaron PI. Se evaluó la intensidad de fluorescencia roja del PI (FL3-H: mayor de 640 nm). Bajo este mismo concepto se analizaron las filas correspondientes a las diversas situaciones en las cuales se evaluó viabilidad celular, incluyendo el control negativo, es decir de células muertas, el cual incluía sobre el 95% de los eventos celulares dentro del segundo marcador descrito Análisis de Ψ y cálculo de razón de fluorescencia roja/verde. Tomando como base, el análisis descrito por Novo y colaboradores en 1999 (Novo y col., 1999, 2000), se utilizó el programa de adquisición y análisis CELLQuest v 1.1. para lo cual se dibujó una ventana de análisis (R1) en función de FSC y SSC, de modo que más del 90% de los eventos celulares estuvieran incluidos (Figura 3). A continuación, en función de FL2-H v/s FL1-H, se definen ventanas de análisis rectangulares a fin de abarcar células polarizadas y depolarizadas (R2 y R3, respectivamente). Los resultados se expresan como porcentaje de cada ventana de análisis respecto de R1. Como el análisis descrito por Novo y colaboradores, considera el cálculo de la razón de fluorescencia roja sobre fluorescencia verde y debido a que el programa CELLQuest v 1.1. funciona en ambiente Macintosh y no permite

62 39 calcular dicha razón, a fin de poder efectuar el cálculo de la razón de fluorescencia roja sobre fluorescencia verde se utilizó el programa Flow Explorer 4.0, el cual funciona en ambiente PC siendo compatible con Windows 9x, NT, 2000 y XP, y que entre sus características, permite explorar archivos con datos de citometría de flujo. Este programa se puede obtener gratuitamente en la dirección web Flow Explorer 4.0 tiene la capacidad de mostrar las propiedades de los archivos con datos, como histogramas, gráficos de punto, contorno y densidad, así como las estadísticas asociadas a ellos. Una característica muy importante de este programa, es la capacidad de agregar notas y editar parámetros y hacer cálculos con los datos. Dentro de los cálculos factibles de efectuar, está el cálculo de razones entre parámetros; cálculos que son guardados como un nuevo archivo. En la Tabla 4 se encuentra el protocolo de cálculo de la razón de fluorescencia roja sobre verde. Una vez obtenido el nuevo archivo (con el cálculo de la razón de fluorescencia roja sobre verde), éste se convierte en un archivo con formato FCS 2.0 mediante el programa FACSConvert (Becton Dickinson), posterior a lo cual se analizó nuevamente en programa CELLQuest v 1.1., donde se graficó y obtuvieron las estadísticas correspondientes. En la Figura 4 se encuentra el diagrama correspondiente a la secuencia de análisis de estimación de Ψ.

63 40 Tabla 4: Protocolo de cálculo de razón de fluorescencia roja sobre verde usando programa Flow Explorer Seleccionar fila 2. Elegir Math 3. Imput Parameters: y1 = FL2-H y2 = FL1-H 4. Math formula: Seleccionar x = y1/y2 5. Output parameter: x = FL3-H 6. New label: Ratio FL2/FL1 7. File renaming: Ingresar nombre de nueva fila 8. Apply calculation to file 9. Confirmation 10. La nueva fila esta lista Figura 4: Diagrama correspondiente a la secuencia de análisis de estimación de Ψ.

64 41 Al graficar la razón de fluorescencia roja sobre verde en un histograma, el pico ubicado a la izquierda (incluido en el marcador 1) corresponde a células depolarizadas, mientras que el pico ubicado a la derecha del histograma (incluido en el marcador 2) corresponde a células polarizadas. Los resultados se expresan como porcentaje de cada marcador de análisis respecto de R Análisis de eflujo bacteriano a bromuro de etidio. En forma semejante al análisis de viabilidad bacteriana, utilizando el programa de adquisición y análisis CELLQuest v 1.1., se dibujó una ventana de análisis (gate) en función de FSC y SSC, de modo que más del 90% de los eventos celulares estuvieran incluidos (Figura 3). Como control positivo, se utilizaron células viables (E. coli), es decir células que no tenían fluorescencia (atribuible al eflujo de bromuro de etidio) y como control negativo, células muertas, es decir células que sí tenían fluorescencia (sin eflujo de bromuro de etidio). Se evaluó la intensidad de fluorescencia roja del BrEt (FL2-H: nm). Bajo este mismo concepto se analizaron las filas correspondientes a las diversas situaciones en las cuales se evaluó la presencia de eflujo al BrEt, incluyendo el control negativo, es decir de células muertas, el cual incluía sobre el 95% de los eventos celulares dentro del segundo marcador descrito.

65 42 3. RESULTADOS 3.1 Determinación de calibración base Debido a que no se tenía experiencia previa en el análisis de bacterias por citometría de flujo, fue necesario establecer la correcta discriminación de bacterias en función de FSC y SSC, logrando de este modo, para los diversos parámetros, un adecuado ajuste de las diversas intensidades de señal, estableciéndose una calibración base sobre la cual trabajar en los subsiguientes ensayos. En la Figura 5 se puede observa la selección de la mejor calibración base y en la Tabla 5 se detalla la misma. Figura 5: Selección de calibración base. En A y B se pierden los eventos pequeños (señal amplificada por un factor de 10), mientras que en C, se pierden los eventos grandes (señal amplificada por un factor de 1000). En D se aprecia la una adecuada discriminación de eventos pequeños y grandes (señal amplificada por un factor de 100). Bacteria usada: E.coli.

66 43 Tabla 5: Detalle de calibración base utilizada (Citometro de flujo FACSCalibur) Detector Voltaje Ganancia amplificador Modo FSC E Log SSC Log FL Log FL Log FL Log Threshold (umbral) Parámetro primario SSC Valor 200 Parámetro secundario Ninguno Compensación FL1-0.0 % FL2 FL2-0.0 % FL1 FL2-0.0 % FL3 FL3-0.0 % FL Análisis de patrones de tamaño Con el objeto de tener un punto de referencia con características similares, en especial en lo que se refiere al índice de refracción, se utilizaron como control, diversas bacterias con características conocidas, las que se representan el histograma de la Figura 6, y en la Tabla 6, se puede apreciar los patrones de tamaño para E. coli (bacilo), P. aeuruginosa (bacilo corto), Acinetobacter spp. (Cocoide y bacilo corto) y Bacillus subtilis (bacilo a bacilo largo).

67 44 Figura 6: Superposición de histogramas para la señal de FSC-H. Representando bacterias con un patrón de tamaño que incluye, cocáceas, bacilos cortos, bacilos y bacilos largos. También se representa la posición de 8 marcadores (incluyendo +/- 100 canales). En la Tabla 7 se muestran los patrones de tamaño para E. coli K12 bajo el efecto de los antibióticos ampicilina, ceftazidima, gentamicina y tetraciclina a concentraciones 0.5 y 2 veces la CMI (Tabla 1).

68 45 Tabla 6: Patrones de tamaño de cepas control. Marcador Canal E. coli P. aeuruginosa Acinetobacter Bacillus subtilis spp. Rango % G Patrón % G Patrón % G Patrón % G Patrón M c 5.22 c M C 6.69 c M BC BC 5.00 Bs M bc BC bc 5.90 Bs M B B M B B M BL M bl %G: porcentaje de la gate. Patrón sugerente: minúsculas. Patrón concordante: mayúsculas. Para E. coli, el patrón concordante es bacilo (marker 5 y 6). Para P. aeuruginosa el patrón concordante es bacilo corto (marker 3 y 4). Para Acinetobacter spp., el patrón concordante es entre cocoide y bacilo corto. Para Bacillus subtilis el patrón concordante es entre bacilo y bacilo largo. Al comparar el control (patrón de bacilo a bacilo corto) con los ensayos con una concentración de antibiótico al doble de la CMI, se puede apreciar un patrón de células cocoides para ampicilina y gentamicina, un patrón de células cocoides a bacilos cortos para ceftazidima y un patrón de células cocoides a bacilares para tetraciclina. En el caso de los ensayos con una concentración de antibiótico de 0.5 veces la CMI, el patrón de tamaño difiere respecto de los ensayos con 2 veces la CMI. Un patrón, principalmente, de bacilo corto se observó con ampicilina. Con ceftazidima y tetraciclina, cambió a un patrón de bacilo a bacilo alargado y para gentamicina, cambió a un patrón bacilar (Figura 7).

69 46 Figura 7: Estimación de tamaño para E. coli K12 frente a diferentes antibióticos. En rojo se representa la intensidad de señal para FSC de la bacteria sin antibióticos. La curva en negro representa 0.5 veces la CMI. La curva en azul representa 2 veces la CMI. En el caso de H. pylori, la Tabla 8 muestra el patrón de tamaño para cinco cepas diferentes, después de un cultivo de 72 horas en medio sólido sin ningún antibiótico. Es interesante señalar que cuatro cepas tuvieron un patrón cocoide a bacilo corto, mientras que una cepa (594-C) tuvo un patrón de bacilo a bacilo alargado, diferencias que fueron claramente observadas.( Figura 8).

70 47 Tabla 7: Patrones de tamaño de E. coli K12 bajo el efecto de diferentes antibióticos (a concentraciones de 0.5 y 2 veces la CMI). Marcador Rango Control Ampicilina Ceftazidima Gentamicina Tetraciclina canal 0.5 CMI 2.0 CMI 0.5 CMI 2.0 CMI 0.5 CMI 2.0 CMI 0.5 CMI 2.0 CMI % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. M C c C c M c C C c C C M bc BC BC BC 5.26 bc bc bc M BC BC 6.56 bc bc 5.19 bc bc 7.44 sb bc M B B 5.28 b B b B B b M b 6.07 b B B 8.10 b B B M bl 5.93 lb M %G: porcentaje de la gate. Patrón sugerente: minúsculas. Patrón concordante: mayúsculas.

71 48 Tabla 8: Patrones de tamaño para diferentes cepas de H. pylori después de un cultivo de 72 horas en medio sólido sin antibióticos. Marcador Rango Cepa 636-C Cepa 594-C Cepa 612-C Cepa 632-C Cepa 633-A canal % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. % G Pat. M c 8.62 c C c C M C C C C M BC bc BC BC M BC 6.34 bc bc BC bc M b B 9.73 b b 9.04 b M b B 5.45 b 4.67 b M BL M lb %G: porcentaje de la gate. Patrón sugerente: minúsculas. Patrón concordante: mayúsculas. Figura 8: Cepas de H. pylori después de incubación por 72 horas. Todas presentan un patrón cocoide a bacilo corto a excepción de la cepa 594-C, que presenta un patrón de bacilo a bacilo alargado.

72 Ensayo de viabilidad celular en E.coli y S. aureus: En la Figura 9, se observa los histogramas correspondientes a la evaluación de viabilidad celular mediante la incorporación de PI. En el histograma correspondiente al control positivo, se dibujó a la izquierda un marcador que incluyera sobre el 95% de los eventos celulares y un marcador (a la derecha del histograma), que incluyera como máximo un 5% de eventos celulares. Las células incluidas en este segundo marcador corresponden a células que incorporaron PI, es decir no viables. Figura 9: Viabilidad bacteriana, mediante la incorporación de PI. (A) Control positivo (células vivas). (B) Mezcla 1:1 de bacteria vivas y muertas. (C) Control negativo (células muertas).

73 50 En el caso de E. coli, al preparar el control de células muertas por calor, en función de FSC y SSC, se logró una buena discriminación de las bacterias, sin alterarse el patrón de tamaño de la población entera (Figura 10). Cuando se evaluó viabilidad en E. coli, en base al protocolo básico de preparación de suspensiones previamente definido (con el cual es posible evaluar linealidad), se obtuvo una muy buena linealidad (R = 0.997) como se puede apreciar en la Figura 11. Figura 10: E. coli. En A bacterias vivas. En B, bacterias muertas por calor.

74 51 Figura 11: Evaluación de linealidad, mediante incorporación de PI, en células de E. coli muertas por calor. A su vez, al preparar el control de células de S. aureus muertas por calor, se formó un precipitado macroscópico que se mantuvo en suspensión, lo que se tradujo en una alteración considerable de las características de FSC y SSC (Figura 12). Al evaluar viabilidad en S. aureus en base al protocolo básico de preparación de suspensiones previamente definido, se obtuvo una baja linealidad (R = 0,692) dada por la asimetría poblacional producto de la probable formación de agregados (Figura 13).

75 52 Figura 12: Células de S. aureus muertas por calor. En B, se puede apreciar la formación de agregados y el aumento de la destrucción celular, con respecto a células vivas (A). Figura 13: Evaluación de linealidad, mediante incorporación de PI, en células de S. aureus muertas por calor.

76 53 Producto de lo anterior se realizaron una serie de experiencias tendientes a lograr establecer un adecuado control de células muertas, tanto para E. coli como para S. aureus, es decir que no alteraran las características de FSC y SSC, y que además se lograra una buena correlación entre el porcentaje de células que incorporan PI y la cantidad de células muertas. En el caso de E. coli se ensayó: etanol al 10%, metanol al 10%, Triton X-100 al 1%, twen 20 al 1% (Figura 14), e incubación a distintos tiempos en una solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol (Figura 15) (FACS TM Lysing Solution; Becton Dickinson) y que normalmente se usa para fijar y permeabilizar células eucariotas. En ninguno de estos casos la incorporación de PI superó el 1.5%. Además, se ensayó una incubación a 70º C por 30 minutos, con la cual se obtuvieron resultados muy similares a la incubación a 100º C por 10 minutos (Figura 16). A su vez, con S. aureus, se ensayó la acción de la agitación mecánica vigorosa (vórtex) durante diferentes tiempos, así como también, la acción de etanol al 10%, metanol al 10%, Triton X-100 al 1%, twen 20 al 1% (Figura 17), e incubación a distintos tiempos con solución de lisis (FACS TM Lysing Solution; Becton Dickinson). Nuevamente, en ninguno de estos ensayos, la incorporación de PI superó el 3.0%, a excepción del Tritón X-100 al 1%, que logró 7.21% (Figura 18). Al ensayar una incubación a 70º C por 30 minutos, se obtuvieron resultados similares a la incubación por 10 minutos a 100º C, con la formación del precipitado macroscópico ya mencionado.

77 54 Figura 14: Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la acción de diversas sustancias. Figura 15: Incorporación de PI en células de E. coli, bajo la acción de solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol.

78 55 Figura 16: Incorporación de PI en células de E. coli tratadas por 30 minutos a 70ºC. Figura 17: Incorporación de PI en células de S. aureus, bajo la acción de solución en base a paraformaldehído y dietilenglicol.

79 56 En la búsqueda de un adecuado control de células muertas, se exploró el concepto de fijación con etanol absoluto a baja temperatura. Este shock frío permite por un lado que las células sean fijadas por el etanol y por otro lado, que no se alteren las características de FSC y SSC, producto de la brusca baja de temperatura. En la Figura 19 es posible apreciar que en el caso de S. aureus, se logró una muy buena incorporación de PI por parte de células sometidas al shock frío, al igual que con E. coli (Figura 20). Cabe destacar que para S. aureus, este procedimiento permitió eliminar la formación de agregados y las características de FSC y SSC fueron óptimas para un adecuado análisis. Además el posterior cultivo en placa de estas células demostró que el shock frío, al menos las transforma en células no cultivables. Cuando se procedió a evaluar viabilidad de E. coli muertas por shock frío, en base al protocolo básico de preparación de suspensiones previamente definido, se obtuvo, en un ensayo en triplicado, una muy buena linealidad (R = 0.978) como se puede apreciar en la Figura 21. A su vez para S. aureus, también en un ensayo por triplicado, la linealidad obtenida fue muy buena (R = 0.981) (Figura 22).

80 57 Figura 18: Incorporación de PI en células de S. aureus, en diversas situaciones. Figura 19: Incorporación de PI en células de S. aureus sometidas a shock frío.

81 58 Figura 20: Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a shock frío. Figura 21: Incorporación de PI en células de E. coli sometidas a shock frío. Ensayo triplicado.

82 59 Figura 22: Incorporación de PI en células de S. aureus sometidas a shock frío. Ensayo triplicado Ensayo de Ψ en E. coli y S. aureus Una vez establecidos los controles en base al protocolo de shock frío, y demostrado que dichas células no son cultivables y no son viables (en base a la incorporación de PI), se utilizaron como controles negativos para Ψ, es decir estas células teóricamente presentaban una depolarización completa de su membrana citoplasmática. En la Figura 23 se muestra un gráfico de FL2-H v/s FL1-H donde se es posible apreciar las regiones correspondientes a células polarizadas y depolarizadas. De igual forma, en la Figura 24, se muestra el

83 60 histograma que representa la razón de fluorescencia roja sobre verde (FL2-H/FL1- H) Figura 23: S. aureus y Ψ. Gráfico de FL2-H v/s FL1-H, que permite dibujar regiones (R2 y R3), que corresponden a células polarizadas y depolarizadas, respectivamente.

84 61 Figura 24: S. aureus. Histograma representando la razón FL2/FL1. Se dibujan los marcadores M1 y M2 que corresponden a células depolarizadas y polarizadas, respectivamente. En S. aureus, y usando el protocolo básico de preparación de suspensiones previamente definido y evaluando igualmente viabilidad celular en cada serie de ensayos, se observó nuevamente una muy buena correlación entre la incorporación de PI y la cantidad de células muertas (Figura 25).

85 62 Figura 25: Incorporación de PI en células de S. aureus muertas por shock frío. Evaluación de linealidad. A su vez, al medir Ψ, en ensayos en triplicado, se obtuvo una muy buena correlación (R = 0.982) entre el porcentaje células que mostraban depolarización y/o polarización y el número de células viables y/o muertas (Figura 26). Igual situación ocurre al calcular la razón de fluorescencia roja/verde (Figura 27). A fin de evaluar la estabilidad en el tiempo de la estimación de Ψ en S. aureus, usando DiOC 2 (3), se efectuaron mediciones en el tiempo a un mismo tubo con bacterias viables, provenientes de un cultivo fresco, a intervalos de 2 minutos durante 30 minutos (protegiendo el tubo de la luz ambiente). Tanto para células polarizadas como para depolarizadas, la estabilidad se mantiene en el tiempo (Figura 28). La misma situación se observa al calcular la razón de fluorescencia roja/verde (Figura 29).

86 63 Figura 26: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de Ψ (marcación con DiOC 2 (3)). Ensayo en triplicado. Figura 27: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de Ψ (razón de fluorescencia roja/verde) en triplicado.

87 64 Figura 28: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de estabilidad en el tiempo de ensayo de Ψ (marcación con DiOC 2 (3)). Figura 29: Células de S. aureus vivas y muertas (shock frío). Evaluación de estabilidad en el tiempo de ensayo de Ψ ( razón de fluorescencia roja/verde).

88 65 Es importante señalar, que una vez cumplido exitosamente el proceso de estandarización de la metodología de estimación de Ψ en S. aureus, se procedió a los ensayos con E. coli. A fin de que la DiOC 2 (3) pueda acceder a la membrana interna, es necesario permeabilizar la membrana externa de la bacteria, para lo cual se utilizó una solución de PBS que además contenía TRIS 10 mm, EDTA disódico 1 mm y glucosa 10 mm. En la Figura 30 se puede observar la comparación entre el uso de PBS-EDTA y sólo PBS. En este último caso, casi el 100% de las células se observan como si estuvieran depolarizadas, y esto es atribuible a la incapacidad de la DiOC 2 (3) de acceder a la membrana interna de la células, situación que se revierte al usar PBS-EDTA. Es importante notar, sin embargo, que se observa un porcentaje basal de células que aparecen como depolarizadas (16.5 %) y lógicamente el porcentaje de células polarizadas es cercano al 83%. Al efectuar el ensayo en triplicado, usando el protocolo básico de preparación de suspensiones previamente definido, con PBS-EDTA, se logró una muy buena correlación entre la incorporación de PI y la cantidad de células vivas (Figura 31). Igual situación se observó entre el porcentaje células que mostraban depolarización y/o polarización y el número de células viables y/o muertas (Figura 32). Idéntica situación se observa al calcular la razón de fluorescencia roja/verde, tanto para células polarizadas y depolarizadas (Figura 33).

89 66 Figura 30: E. coli. Incorporación de Dioc2(3), según el buffer usado. Figura 31: Evaluación de linealidad en la Incorporación de PI de células de E. coli en PBS-EDTA.

90 67 Figura 32: Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de Ψ (marcación con DiOC 2 (3)). Ensayo en triplicado. Figura 33: Células de E. coli en PBS-EDTA vivas y muertas (shock frío). Evaluación de linealidad de ensayo de Ψ (razón de fluorescencia roja/verde). Ensayo en triplicado.

91 Ensayo de viabilidad celular en Helicobacter pylori: Para evaluar viabilidad en H. pylori ATTC 43504, se prepararon suspensiones celulares en caldo MH filtrado, a partir de un cultivo en placa con 3 días de incubación. Luego de preparar células muertas (por calor y shock frío), una alícuota se resuspende en PBS y se adiciona PI (10 µg/ml concentración final). En la Figura 34 se muestra que el porcentaje de incorporación de PI por parte de células teóricamente muertas, fue mínimo (no mayor al 13,8%). Luego de repetir el ensayo, variando tanto el cultivo celular, como los tiempos de incubación con PI (normalmente son 5 minutos), los resultados se mantuvieron, no descartándose que el PI sea incapaz de acceder a la célula. Figura 34: H. pylori. Incorporación de PI (PBS-EDTA).

92 Ensayo de Ψ en Helicobacter pylori Al igual que para el ensayo de viabilidad, se prepararon suspensiones celulares en caldo MH filtrado, a partir de un cultivo en placa con 3 días de incubación, resuspendiéndose en PBS-EDTA. Se observó cerca de un 80% de células aparentemente depolarizadas, incluso en el caso de células teóricamente viables y que deberían haber aparecido como polarizadas. El porcentaje de células teóricamente polarizadas no superó el 6.5% (Figura 35). A fin de descartar la presencia de un sistema de eflujo que expulse los fluorocromos hacia el exterior de la células, se implementó la medición de eflujo a BrEt en E. coli, como base para posteriores ensayos con H. pylori. Figura 35: H. pylori en PBS-EDTA. Evaluación de Ψ (marcación con DiOC 2 (3)).

93 Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en E.coli y S. aureus: Para analizar la presencia de un eflujo para BrEt, como se observa en la Figura 36, en el histograma correspondiente al control positivo, es decir células que sí presentaban eflujo a BrEt, se dibujó a la izquierda un marcador que incluyera sobre el 95% de los eventos celulares y un marcador (a la derecha del histograma), que incluyera como máximo un 5% de eventos celulares. Las células incluidas en este segundo marcador corresponden a células sin la capacidad de eflujo al BrEt (no viables). Al ensayar tres puntos (células vivas, células muertas y una mezcla 1:1 de ambas), se obtuvo una curva lineal muy similar a la producida por el ensayo de viabilidad con PI (Figura 37). Figura 36: Eflujo a BrEt en E. coli. En A control positivo (células vivas) y en B control de negativo (células muertas).

94 71 Figura 37: E. coli (células vivas y muertas). Evaluación de linealidad para incorporación de PI y para eflujo a BrET. En S. aureus, si bien el control positivo mostró un valor coincidente con la presencia teórica de un eflujo a BrEt, el control negativo, es decir células muertas y que deberían haber mostrado una alta fluorescencia, mostró sólo un 61%; sin embargo, se conservó la linealidad (Figura 38). Lo anterior se podría explicar por la incapacidad de BrEt de ingresar completamente a la célula muerta.

95 72 Figura 38: S. aureus (células vivas y muertas). Evaluación de linealidad para incorporación de PI y para eflujo a BrET Ensayo de eflujo de bromuro de etidio en H. pylori: Al ensayar tres puntos, se obtuvo una baja intensidad de fluorescencia (cercana al 15 %), tanto en células vivas, células muertas y en la mezcla 1:1 de ambas. Con este resultados se puede pensar, que H. pylori, no presentaría un sistema de eflujo de BrEt, o bien por alguna razón el BrEt no es capaz de acceder a la célula. A fin de intentar confirmar lo anterior, se intentó evaluar en H. pylori (usando como referencia E. coli y S. aureus), viabilidad celular con PI, Ψ con DiOC 2 (3) y eflujo de BrEt bajo la acción de ionóforos, inhibidores de bombas de eflujo y sustancias que alteran la cadena transportadora de electrones.

96 Acción de CCCP sobre la viabilidad celular, Ψ y el probable eflujo de bromuro de etidio en S. aureus: A partir de un cultivo bacteriano líquido en fase exponencial, se ensayó la acción de Carbonyl cyanide m-chlorophenyl-hydrazone (CCCP) sobre S. aureus, a diferentes tiempos (0, 10, 30, 60 y 120 minutos y a las 18 horas). En cada punto se evaluó (incluyendo un control sin CCCP) viabilidad celular con PI, estimación de Ψ y probable eflujo de BrEt, según los protocolos ya descritos. La viabilidad celular y el probable eflujo de BrEt, no fue afectada por la acción del CCCP (Figura 39), a diferencia de la clara acción ejercida en el tiempo sobre el Ψ (Figura 40), acción que se intensificó en el tiempo, demostrándose la acción del CCCP como ionóforo de protones. Figura 39: Células vivas de S. aureus. Acción de CCCP sobre la viabilidad celular y el eflujo a BrEt.