Unidad de Microbiología Depto. Patología y Terapéutica Experimental

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1 U UNIVERSITAT DE BARCELONA B Unidad de Microbiología Depto. Patología y Terapéutica Experimental Facultad de Medicina - Campus de la Salud de Bellvitge Pabellón Central 5ª planta C. Feixa Llarga s/n L Hospitalet de Llobregat (Barcelona) Tel Fax dep-ptex-bell@ub.edu Informe Científico Tecnico Productos textiles para diabéticos

2 U UNIVERSITAT DE BARCELONA B Unidad de Microbiología Unidad de Microbiología Depto. Patología y Terapéutica Experimental Depto. Patología y Terapéutica Experimental Facultad de Medicina - Campus de la Salud de Bellvitge Facultad Pabellón de Central Medicina 5ª planta - Campus de la Salud de Bellvitge Pabellón C. Feixa Central Llarga s/n 5ª planta C Feixa L Hospitalet Llarga s/n de Llobregat (Barcelona) Tel. 93 L Hospitalet de Llobregat Fax (Barcelona) Tel dep-ptex-bell@ub.edu Fax dep-ptex-bell@ub.edu Informe Científico Tecnico Productos textiles para diabéticos

3 1 INFORME CIENTÍFICO-TÉCNICO 1 Introducción La empresa KENTEXPORT S.L.ubicada en la provincia de Barcelona, tiene como uno de los objetivos preferentes el desarrollo de productos textiles con propiedades particulares que justifiquen su utilización en segmentos o actividades que confieran a sus productos un alto valor añadido El Pie diabético El pie de enfermos diabéticos es una diana especialmente apta para el establecimiento de infecciones de origen bacteriano. Los géneros más significativos en la práctica clínica son Staphylococcus aureus, la especie característica de este tipo de infecciones; Streptococcus: diversas especies de estreptococos han podido ser aisladas de las ulceras plantares analizadas; y, finalmente, Pseudomonas aeruginosa. Otras especies son también capaces de infectar las úlceras plantares. España constituye una zona geográfico-social en la que la incidencia de las resistencias a los antibióticos por parte de las bacterias es muy elevada. Se ha determinado que la mayoría de las resistencias que ocasionan graves problemas de tratamiento en el mundo proceden, o como mínimo son detectables en las cepas españolas. En muchos casos la literatura científica habla de clones españoles para referirse a aquellos biotipos bacterianos con mayores niveles de resistencia, lo cual no siempre viene apoyado por evidencias científicas suficientes. Sin embargo no puede discutirse que la resistencia a los antibióticos en España es un problema de salud pública de primera magnitud. En el caso de enfermos diabéticos y complicaciones infecciosas del pie diabético esta resistencia es el origen de dificultades en el tratamiento. Por lo tanto la prevención de las infecciones en la enfermedad perforante plantar constituye un objetivo de primera línea en la medicina podológica de enfermos diabéticos. Kentlan es un producto desarrollado por la empresa solicitante. Se trata de un tejido con presunta actividad antibacteriana. El planteamiento del trabajo se centra en elaborar calcetines a base de Kentlan que contribuyan a estabilizar, o incluso eliminar las poblaciones microbianas de la superficie del pie, constituyendo una herramienta en la prevención de las infecciones de las úlceras plantares.

4 2 INFORME CIENTÍFICO-TÉCNICO 2 Material y Métodos El poder bacteriostático y bactericida se ha determinado siguiendo distintos métodos de 2.1. Determinación utilización general en los laboratorios especializados. Por una parte se ha determinado el poder del poder bactericida y del poder antimicrobiano de los tejidos objeto de estudio mediante pruebas cualitativas en placa en las cuales bacteriostático pudiera ponerse de manifiesto la capacidad bactericida, la capacidad de difusión del efecto bactericida así como la capacidad bacteriostática de los productos a ensayar. Para ello se realizaron cultivos de las diferentes especies bacterianas ensayadas, en medio Mueller- Hinton. Se diluyeron los cultivos hasta conseguir una suspensión bacteriana que contuviera aproximadamente 10 6 UFC/ml. A partir de cada uno de los cultivos diluidos, se sembraron en superficie de placas conteniendo Mueller-Hinton Agar. En cada una de las placas sembradas, se depositó una pieza de producto a ensayar o tejido control (de una superficie de 1.5cm 2 aprox.). Cuando se trataba de averiguar el efecto sobre el poder antibacteriano de alguno de los tratamientos ensayados, previamente se había sometido el producto a dicho tratamiento. Las placas se incubaron a 37ºC ± 1 y se procede a su lectura a las 24h, midiendo en milímetros el diámetro del halo de inhibición que se forma alrededor de la pieza en el cual se ha inhibido el crecimiento del microorganismo. En los casos en que el halo era invisible, se procedió a levantar la pieza de tejido y a observar la presencia o ausencia de crecimiento visible en la zona que había contactado durante la incubación con el tejido.

5 3 INFORME CIENTÍFICO-TÉCNICO 2Condiciones de cultivo Determinación cuantitativa de los índices de poder bactericida y bacteriostático Las cepas bacterianas se mantuvieron a -80ºC en TSB (Caldo de Tripticase y Soja) con Glicerol al 10%. Para cada experimento se tomaron alícuotas de las suspensiones ultracongeladas que se suspendieron en 5 ml medio de TSB y se incubaron a 37ºC (±1ºC). La pureza de los cultivos se comprobó en todos los casos mediante siembra en estría sobre agar de tripticase y soja (TSA) contenido en placas de Petri que se incubaron durante 24 horas tras lo que se inspeccionó la morfología colonial de las bacterias desarrolladas. A partir del primer cultivo en líquido se incubaron 20 ml de TSB en frascos Erlenmeyer de 100 ml de capacidad en baño metabólico con agitación recíproca a 100 rpm (recorrido de 3 cm). Después del cultivo las bacterias se diluyeron en agua estéril hasta la absorbancia deseada a 600 nm de longitud de onda mediante la utilización de curvas de calibración densidad óptica/número viable Preparación de los inóculos Los inóculos se prepararon por dilución del cultivo hasta alcanzar un número viable de 1± 0.4 x 10 4 cfu/ml (cfu. Unidades formadoras de colonia). Para la determinación de los índices bactericida y bacteriostático se utilizaron las cepas Styaphylococcus aureus ATCC 6538 y Klebsiella pneumoniae ATCC 4352 que son las cepas recomendadas por los organismos internacionales para la determinación del poder antimicrobiano de los productos textiles. Las cepas pertenecientes al resto de las especies fueron obtenidas de la colección CSUB (Colecció de Soques de la UB a Bellvitge)

6 4 INFORME CIENTÍFICO-TÉCNICO 2 Las 2.4. Inoculación de las muestras muestras de producto textil se cortaron en piezas de 1.5 cm cuadrados; cada muestra se inoculó con 200 µl /muestra incorporando pequeñas porciones del inóculo de modo que el tejido absorbiera toda la suspensión de inóculo. Cada muestra se procesó por triplicado 2.5. Trabajo experimental en pie humano diabético Siete voluntarios, enfermos diabéticos atendidos en la Clínica Podológica Universitaria de la Universidad de Barcelona participaron en el estudio. Se trata de enfermos muy concienciados de su enfermedad y que cumplen todas las recomendaciones de cuidado personal y sanitario para hacer frente a la diabetes. Para la recogida de muestras se eligió el método más ampliamente utilizado basado en el muestreo por contacto. Éste consistió básicamente en la aplicación sobre la superficie de la piel del paciente de placas de contacto RODAC en las que el medio de cultivo está en ligero exceso. En la base de estas placas está grabada una cuadrícula, de superficie determinada que permite el cálculo de la concentración de los microorganismos que han formado colonia. El resultado se expresa en ufc/cm2. La principal ventaja de este método es su sencillez; mientras que el principal inconveniente es que superficies muy sucias van a provocar la sobrecarga de la placa y, por tanto dificultar el análisis de la misma. En la figura 9 se muestra una placa RODAC y las colonias crecidas. FIGURA 9 Placas de contacto RODAC para el muestreo de superficies

7 5 INFORME CIENTÍFICO-TÉCNICO 2En nuestro estudio, se utilizó medio de cultivo rico TSA (Agar de Triptona y Soja) para aislar los microorganismos procedentes de la piel de los pacientes. Éstos se eligieron de forma que presentaran un cuadro patológico de Pie Diabético. Se recogieron seis muestras por paciente: dorso del pie, talón y canto, antes y después del uso del calcetín. Una vez recogidas las muestras, las placas se incubaron durante 48 h a 37ºC, momento en que se procedió al recuento de las diferentes colonias. El resultado del recuento de las colonias desarrolladas se expresa en ufc/cm2 (unidades formadoras de colonia/cm2) 2.6. Cálculos Valor de la prueba: Estos valores indican la validez de la prueba. Son aceptables valores superiores a 1.5. Vc = Log N c 24 Log N o Donde Nc 24 es el número de bacterias tras 24 horas de incubación en la tela control y N0 es el número de bacterias depositadas sobre la muestra al inicio del experimento como Indice bactericida: es un índice que indica el poder bactericida del tejido problema. Se define Ib = Log N c 0 Log N p 24

8 6 INFORME CIENTÍFICO-TÉCNICO 2Donde Nc 0 es el número de bacterias después de la inoculación (t=0h) en la tela control y Np24 es el número de bacterias tras 24 horas de incubación en la tela problema. Indice bacteriostático: es un índice que indica el poder bacteriostático del tejido problema. Se define como Is = Log N c 24 log N p 24 Donde N c24 es el número de bacterias tras 24 horas de incubación en el tejido control y N p24 es el número de bacterias tras 24 horas de incubación en el tejido problema. Porcentaje de reducción: es también un indicador de la capacidad antimicrobiana del tejido, aunque cuando los inóculos son grandes (> 10 4 ) sugiere potenciales mayores que los reales. Porcentaje de reducción= (log N c 24 - Log N p 24 )/ log N c 24 x 100 Donde N c 24 el número de bacterias tras 24 horas de incubación en el tejido control y N p 24 es el número de bacterias tras 24 horas de incubación en el tejido problema

9 7 INFORME CIENTÍFICO-TÉCNICO 3 Resultados Valor de la prueba: los valores indican la validez del experimento cuando son superiores a 1,5. Klebsiella pneumoniae Vc = = 3.7 Staphylococcus aureus Vc = 7.8-3,5 = 4.3 Por lo tanto ambos son válidos Indice bactericida Klebsiella pneumoniae -0.6 Staphylococcus aureus 3.2 Indice bacteriostático IKlebsiella pneumoniae 3.17 Staphylococcus aureus 7.5 Indice de reducción Klebsiella pneumoniae % Staphylococcus aureus % Experimentos sobre pies diabéticos: Las poblaciones microbianas superficiales se mantienen constantes a lo largo del tiempo.

10 8 INFORME CIENTÍFICO-TÉCNICO Conclusión Puede considerarse el efecto antimicrobiano de Kentlan como muy elevado. La actividad bactericida es considerable, aunque tiende a perderse tras lavados sucesivos. Por el contrario la actividad bacteriostática se mantiene a lo largo del tiempo. Ello hace que el uso de calcetines hechos de este material mantenga las poblaciones de la superficie del pie constantes a lo largo del tiempo, impidiendo la proliferación de microorganismos que presuntamente pueden infectar las úlceras plantares. Barcelona, 6 de Febrero de Fdo. Carolina Padrós Clínica Podológica Universitaria César Escribano Investigador VºBº Miguel Viñas Catedrático de Microbiología