ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO A MICRO-ESCALA DE QUÍMICA SANGUÍNEA POR ESPECTROFOTOMETRÍA

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1 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO A MICRO-ESCALA DE QUÍMICA SANGUÍNEA POR ESPECTROFOTOMETRÍA Maria José Falcón Iracheta y Dr. Jorge Alejandro Alegría Torres Laboratorio de Investigación Molecular en Nutrición (LIMÓN), Universidad del Centro de México, Capitán Caldera 75, Col. Tequis. San Luis Potosí, S.L.P. C.P RESUMEN Esta investigación se centró en el desarrollo de un método espectrofotométrico a micro-escala en lector de placa de 96 pozos para determinar la concentración de glucosa, triglicéridos, colesterol total y colesterol HDL Una vez validado, este método fue utilizado para realizar el análisis clínico de estos analitos así como de VLDL y LDL calculado por fórmula en 200 participantes de un estudio cuyo objetivo es identificar rasgos de Síndrome Metabólico en el personal académico y administrativo del instituto OTHÓN-UCEM. A través de la implementación de esta metodología se redujo el tiempo y los costos que se necesitan al realizar determinaciones de este tipo, y así poder brindar un resultado de laboratorio eficiente y confiable. INTRODUCCIÓN Para que nuestro organismo funcione de manera adecuada es necesario proveerlo de ciertos compuestos que son necesarios para la obtención de energía de las células del cuerpo. Algunos de estos compuestos importantes es la glucosa que gracias a esta molécula compuesta principalmente por C, O, e H ayuda a la célula a proveerla de energía para desarrollar las funciones vitales de la misma. La mayor parte de los lípidos que se encuentran en el organismo son en forma de triglicéridos,

2 un tipo de lípido obtenido por medio de la dieta y principal reserva energética en el organismo. El colesterol es lípido presente en el organismo que circula por el torrente sanguíneo, esencial para la biosíntesis de hormonas esteroideas, ácidos biliares, membranas celulares y lipoproteínas, como las de alta densidad (HDL), baja densidad (LDL) y muy baja densidad (VLDL, por sus siglas en ingles). Este tipo de lipoproteínas circulan libremente por el torrente sanguíneo ocasionando diferentes efectos en el organismo según su concentración, estos efectos pueden ser positivos o negativos, dependiendo de la lipoproteína presente, en el caso de las HDL o lipoproteínas de alta densidad ayudan a remover a las LDL o lipoproteínas de baja densidad y VLDL o lipoproteínas de muy baja densidad que se quedan estancadas en las arterias impidiendo la circulación, para posteriormente transportarlas al hígado y que de esta manera puedan ser metabolizadas o excretadas. En el momento que las concentraciones de estos compuestos rebasan el límite permitido se pueden desarrollar ciertas complicaciones en el organismo favoreciendo la aparición de enfermedades crónicas tales como la diabetes mellitus II o enfermedades cardiovasculares. Para poder monitorear y conocer las concentraciones reales de estas moléculas en el plasma sanguíneo se requiere de estudios específicos para cada uno de estos compuestos. Una de las técnicas utilizadas en este tipo de análisis es por medio de espectrofotometría. Este método es perfectamente descrito por el principio de Lambert-Beer, según el cual la concentración es directamente proporcional a la absorbancia de luz o energía de la muestra a analizar. MATERIALES Y MÉTODOS Dentro de la investigación de identificación de rasgos de síndrome metabólico en el personal del OTHÓN-UCEM se desarrolló un método a micro-escala, para la determinación de glucosa, triglicéridos colesterol total y colesterol HDL en plasma sanguíneo por medio de espectrofotometría. Para ello se realizaron controles de calidad para comprobar la efectividad y confiabilidad del método. Se evaluó la linealidad, repetibilidad y reproducibilidad del método. De acuerdo a los protocolos descritos por el proveedor (glucosa triglicéridos, colesterol total y colesterol HDL de Bio-Systems ), se ajustó el volumen de forma proporcional reduciéndolo 5 veces. Para linealidad se utilizaron diferentes volúmenes de plasma: 2µL, 4 µl, 6 µl, 8 µl y 10 µl, utilizando 200µL de reactivo. Las determinaciones se hicieron por triplicado en una placa de 96 pozos con pipetas automáticas p20 y p200, para posteriormente leerlas en el

3 espectrofotómetro (BIO-RAD, xmark microplate) a una longitud de onda de 500nm. Con los resultados obtenidos de las lecturas se realizó una curva para evaluar el coeficiente de correlación (r²), que según el control de calidad establecido debería de ser igual o mayor a Para repetibilidad se calculó el Coeficiente de Variación (CV) obtenido a partir de 20 repeticiones de una misma muestra. Para reproducibilidad se analizaron 20 muestras en días diferentes para calcular el CV entre pares. Tabla 1. Glucosa Glucosa Normal Muestra 10 µl 4 µl Reactivo 1000µL 200 µl Tabla 2. Colesterol HDL Colorimetría HDL normal escala Sobrenadante Muestra 100 µl 20 µl Reactivo 1000 µl 200 µl Precipitante HDL Normal escala Muestra 200 µl 40µL Reactivo 500 µl 100µL

4 Tabla 3. Colesterol total y TGL TGL/ Colesterol Total normal Muestra 10 µl 3 µl Reactivo 1000µL 200 µl RESULTADOS Como se puede observar en las gráficas 1, 2, 3 y 4 en donde se muestran los resultados de linealidad para glucosa, triglicéridos, colesterol total y colesterol HDL), el el coeficiente de correlación (R²) fue cercano a 1. Para los resultados de repetibilidad se obtuvieron los siguientes coeficientes de variación para cada uno de los analitos: Glucosa: 4.49%, Triglicéridos: 7.24%, Colesterol Total: 7.24%, Colesterol HDL: 7.24 %. A pesar que no alcanzar los CV recomendados por el proveedor, el criterio de aceptación se basa en la reducción de los volúmenes por lo cual en todo momento las determinaciones se realizaron por triplicado y el resultado fue aceptado siempre que la desviación estándar haya sido menor a Posteriormente de la aplicación de los controles de calidad se analizaron cerca de 200 muestras de plasma sanguíneo. Gracias a los resultados obtenidos de la determinación de glucosa, triglicéridos colesterol total y colesterol HDL, se pudieron determinar las concentraciones de colesterol LDL y VLDL por medio de la fórmula de Friedewald, descritas a continuación: LDL = CT-((TGL/5)+ HDL) VLDL = TGL/5

5 Gráfica 1.Glucosa Gráfica 2. Triglicéridos

6 Gráfica 3. Colesterol total Gráfica 4. Colesterol HDL

7 CONCLUSIONES Gracias a la estandarización del método a micro-escala se pueden analizar simultáneamente 30 muestras por triplicado en lector de placa de 96 pozos, esto con el fin de reducir los tiempos al momento de analizar una cantidad considerable de muestras, y además, reducir los costos de las pruebas realizadas al ser menor los volúmenes de reactivo. Para concluir con la investigación se realizaron protocolos estandarizados para su futuro uso dentro del laboratorio. REFERENCIAS tml Christopher K. Mathews, Kevin G. Ahern, K. E. Van Holde. Metabolismo lipídico de los ácidos grasos,tricilgliceroles y lipoproteínas. En Bioquímica (2002). (pp: ). Ed. Pearson Education.