MEDIDAS DE INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO: HEMAGLUTINACIÓN

Transcripción

1 Departamento de Inmunología Facultad de Medicina MEDIDAS DE INTERACCIÓN ANTÍGENO-ANTICUERPO DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO: HEMAGLUTINACIÓN I. Introducción. La determinación del grupo sanguíneo es una práctica habitual e imprescindible para la transfusión de componentes hemáticos. Ello es debido a que el sistema inmune de algunos individuos rechaza los hematíes de otros. Esta reacción inmunológica está mediada por anticuerpos y es fácilmente visualizable in vitro mediante reacciones de aglutinación. Se conocen más de 20 grupos de antígenos eritrocitarios codificados en otros tantos loci génicos, para los cuáles existen múltiples variantes alélicas. El resultado son más de 200 antígenos eritrocitarios identificables. Estos antígenos varían en su inmunogenicidad. Los más importantes a efectos transfusionales son los antígenos de sistema H/ABO y los del sistema Rhesus (Rh). II. Conceptos Se define antígeno como la sustancia capaz de unirse a los receptores específicos de los linfocitos y desencadenar una respuesta inmunitaria específica. Para que una sustancia sea antigénica debe de poseer una serie de características : Composición química variable. Peso molecular elevado. Se define inmunógeno aquellas moléculas capaces de generar una respuesta inmunitaria. Mientras que se define como hapteno una sustancia que tiene la capacidad de unirse al receptor de los linfocitos, pero es incapaz de generar una respuesta inmunológica. El proceso de reconocimiento o de unión del antígeno no sucede de forma global, sino que se trata de un reconocimiento parcial de dicha molécula, dicha región se conoce como determinante antigénico o epitopo. La presencia de determinantes múltiples se conoce como multivalencia, o en el caso de un número excesivo de determinantes, polivalencia. Se diferencian dos grandes tipos de determinantes antigénicos : a) Secuenciales o lineales b) Conformacionales. c) Neoantígenos

2 En los primeros, el reconocimiento se establece a nivel de la secuencia. P.ej. secuencia de aa. Mientras que en los determinantes conformacionales se produce el reconocimiento en la estructura nativa del antígeno, a nivel de su estructura secundaria o terciaria. Por último, los neoantígenos, las proteínas pueden estar sometidas a modificaciones covalentes como fosforilación o proteólisis específica. Estas modificaciones, que alteran la estructura covalente, pueden producir nuevos epítopos antigénicos, pudiendo ser reconocidos por anticuerpos específicos. Interacción antígeno-anticuerpo: La interacción entre antígeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces débiles, como puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Wals e interacciones electrostáticas e hidrofóbicas. La suma de todos estos enlaces genera una interacción estable entre el lugar de unión del anticuerpo (paratopo) y el lugar de unión del antígeno (epítopo). La relación entre un antisuero o anticuerpo determinado y el antígeno que ha dado lugar a su producción se conoce como interacción específica. Cuando el antisuero da reacción positiva con otros antígenos, relacionados o no con el utilizado en la inmunización, se habla de reacción cruzada. Definición de afinidad y avidez: La suma de estas fuerzas de atracción y de repulsión se conoce como afinidad del anticuerpo. Los anticuerpos son moléculas multivalentes en su interacción con el antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina presentan un máximo de 10 (IgM) y un mínimo de 2 brazos de unión con el antígeno. En el caso de que este último también sea multivalente, presentará un mínimo de dos puntos de anclaje para el anticuerpo correspondiente. Esta interacción multivalente entre antígeno y anticuerpo permite introducir el concepto de avidez. Para la detección de anticuerpos se utilizan diversos tipos de pruebas que se agrupan según necesiten o no un sistema indicador de que se ha producido la unión antígeno-anticuerpo. Interacciones primarias: Son pruebas en las que la unión antígeno-anticuerpo no produce cambios físicos que pongan de manifiesto la interacción, por lo que debe utilizarse un sistema indicador. Son técnicas más sensibles y específicas. Algunas de las más utilizadas dentro de este grupo son: a) Inmunoflorescencia b) ELISA c) Immunoblotting

3 Inmunoflorescencia. En la mayor parte de los casos se utiliza la inmunofluorescencia indirecta, en la que la reacción antígeno-anticuerpo se revela con un segundo anticuerpo marcado con una molécula fluorescente. Si el anticuerpo marcado con la molécula fluorescente es el que reacciona directamente con el antígeno se denomina inmunofluorescencia directa. ELISA. El antígeno está fijado sobre un soporte sólido y la reacción antígeno anticuerpo se revela con un segundo anticuerpo marcado con un enzima que produce una reacción coloreada al añadir un sustrato cromogénico. Immunoblotting. Se utiliza para estudiar la presencia de anticuerpos frente a mezclas complejas de antígenos. En primer lugar se separan los antígenos según su peso molecular por medio de una electroforesis y los antígenos se transfieren a la superficie de láminas de nitrocelulaosa donde pueden reaccionar con los anticuerpos. La reacción antígeno anticuerpo se revela con un segundo anticuerpo marcado con un enzima que produce una reacción coloreada al añadir un sustrato cromogénico. Interacciones secundarias: Pruebas que no necesitan un sistema indicador de la unión antígeno-anticuerpo, ya que se dan cambios físicos que ponen de manifiesto que ha ocurrido la interacción. Las pruebas más utilizadas dentro de este grupo son: a) Inmunoprecipitación b) Aglutinación Inmunoprecipitación. Se utiliza para detectar anticuerpos contra un antígeno o para comparar los antígenos presentes en mezclas antigénicas complejas. En esta prueba se utilizan antígenos solubles que se depositan en un pocillo de un gel de agarosa enfrentado a otro pocillo que contiene los anticuerpos. A partir de ambos pocillos se produce una difusión radial y en la zona donde se encuentran el antígeno y el anticuerpo en las proporciones adecuadas se produce un precipitado que pone de manifiesto la reacción antígeno-anticuerpo. Esta técnica recibe diferentes denominaciones (doble inmunodifusión, inmunoelectroforesis, contrainmunoelectroforesis, etc.) dependiendo de algunas variaciones técnicas que se han introducido para el estudio de mezclas antigénicas complejas. En general, es una técnica poco sensible para detectar bajos niveles de anticuerpos. Aglutinación. Se utiliza para detectar anticuerpos contra antígenos localizados en la superficie de células o de partículas de látex. Los anticuerpos al unirse al antígeno producen una unión de las células o partículas denominada algutinación. Esta técnica es más sensible que la inmunoprecipitación. III. Grupos sanguíneos Sistema H/ABO El primer sistema descubierto, en 1900, fue el AB0, por ser la principal causa de la incompatibilidad entre las sangres de distintos individuos en las transfusiones de sangre. Dicha incompatibilidad se basa en una reacción de carácter inmunológico altamente específica, consistente en la unión química de antígenos extraños contenidos

4 en los eritrocitos del donante y las aglutininas o anticuerpos específicos presentes en el plasma sanguíneo del receptor. El grupo sanguíneo AB0 lo determina un locus situado en el extremo del brazo largo del cromosoma 9. Constituye un caso de alelismo múltiple basado en la existencia de tres alelos: A que da lugar a la producción de antígenos A. B que da lugar a la producción de antígenos B. 0 que determina no producción de antígenos. Los alelos A y B son codominantes, mientras que 0 es recesivo frente a ambos. Estas características determinan la existencia de cuatro fenotipos. El sistema AB0 puede resumirse en el siguiente cuadro: Fenotipos Genotipos Antígenos en los eritrocitos Anticuerpos en suero A A/A ó A/0 A anti-b B B/B ó B/0 B anti-a 0 0/0 Ninguno anti-a y anti-b AB A/B A y B ninguno Las personas que poseen en sus eritrocitos un tipo de antígeno carecen del anticuerpo respectivo, pero este último está presente en el suero de las personas que carecen de dicho antígeno. Por lo tanto, en una transfusión se producirá reacción de aglutinación antígeno-anticuerpo o no según los casos, tal como se indica en el siguiente cuadro: Origen de los eritrocitos (donante) Origen del suero (receptor) A B AB 0 A B AB

5 Sistema Rhesus El sistema Rhesus descubierto por Landsteiner, Wienes y Levine en En un primer análisis y para simplificar se consideran dos grupos en este sistema: - Rh+, individuos que poseen antígenos Rh. - Rh-, indviduos que no poseen antígenos Rh. Los anticuerpos anti-rh no son anticuerpos naturales, no existen normalmente en la sangre, pero aparecen en individuos Rh- que han recibido antígenos Rh como consecuencia de una transfusión de un donante Rh+ o después de un embarazo. La madre Rh- se sensibiliza por los eritrocitos Rh+ del primer hijo, produciendo anticuerpos anti-rh. El segundo embarazo de un niño Rh+ produce un aumento masivo de anticuerpos, que pasan a través de la placenta y aglutinan los glóbulos rojos del niño. Este sistema reveló la explicación de una enfermedad hemofílica que se produce en el recién nacido, la eritroblastosis fetal, además de las reacciones de aglutinación que ocurrían en transfusiones de sangre entre personas del mismo tipo respecto al sistema AB0. Las bases genéticas del sistema Rh son complejas, al estar constituido por un gran número de antígenos eritrocitarios distintos. Este sistema está codificado por tres loci muy próximos entre sí (C, D, E y sus recesivos respectivos c, d, y e) en el brazo corto del cromosoma 1. Cada uno de los alelos produce un antígeno y los anticuerpos correspondientes aparecen para todos menos para el d. El alelo D, es de un interés primordial al ser el responsable de la codificación del antígeno D que es muy antigénico y provoca la sensibilización. Es por esto que para fines prácticos las personas se consideran Rh+ si poseen el antígeno D y Rh- si carecen del antígeno D según la siguiente tabla: Genotipo DD + Dd + dd - Rh

6 Test de Coombs Detecta anticuerpos contra los glóbulos rojos en circulación. Es importante para la determinación de la compatibilidad entre donante y receptor en el caso de transfusiones de sangre. Detecta también la presencia de anticuerpos anti Rh en la madre durante el embarazo. Evalúa la necesidad de administrar inmunoglobulina Rho (D). Ayuda a confirmar el diagnóstico de anemia hemolítica. Sistema Duffy: Los alelos de este sistema (Fy a y Fy b ) están controlados por alelos codominantes. Es destacable el hecho de que muchos individuos de raza negra con alta endecimicidad al paludismo por Plasmodium vivax presenten un tercer alelo alternativo Fy (a-b-). Esto ocurre en comunidades con alta endemicidad, donde la exposición a los anofelinos infectantes es contínua durante muchos años, los adultos muestran resistencia a la enfermedad, relacionada con la ausencia del factor Duffy en sus eritrocitos. Sistema Kell: Este sistema incluía inicialmente el par alélico K y k, siendo este último el más frecuente. El sistema comprende ahora dos pares alélicos adicionales y algunas variantes. El antígeno K es muy inmunogénico y uno de cada 20 individuos transfundidos con células K+ desarrolla el anticuerpo. Importancia clínica. Anemias hemolíticas por aloanticuerpos. Reacciones hemolíticas postransfusionales. Las reacciones hemolíticas postransfusionales se producen cuando se transfunden hematíes que contienen antígenos para los cuáles el receptor tiene anticuerpos. Estos pueden ser naturales (sistema ABO) o inmunes (Rh y otros sistemas). El cuadro clínico es muy variable y depende del grado de respuesta del receptor, la capacidad antigénica del antígeno, la avidez del anticuerpo y la temperatura óptima de acción de éste. Puede manifestarse por una simple reacción de escalofríos e hipertermia, hasta un cuadro clínico grave con dolor lumbar, hipotensión, shock e insuficiencia renal. El diagnóstico se efectúa al comprobar una aumento de la LDH sérica, un descenso de la haptoglobina, hemoglobinemia y hemoglobinuria. Estas reacciones pueden ser fácilmente evitadas administrando hematíes compatibles y no cometiendo errores de identificación, tanto de muestras como de pacientes. Enfermedad hemolítica del recién nacido La enfermedad hemolítica del recién nacido (EHRN) se produce cuando existe una incompatibilidad entre los antígenos eritrocitarios de la madre y los del feto. Aunque el ejemplo clásico es la isoinmunización por el antígeno D del sistema Rh (por ser el más inmunogénico), cualquier antígeno de grupo sanguíneo ausente de la madre y presente en el feto puede inducir la formación de aloanticuerpos que causan la hemólisis neonatal.

7 Diagnóstico. Se puede efectuar antes del nacimiento mediante la detección de anticuerpos en el suero de la gestante. En el momento de nacer, la prueba de la antiglobulina directa (Test de Coombs directo) sobre los hematíes del recién nacido e indirecta (Test de Coombs indirecto) en el suero de la madre con otras ictericias neonatales. En el caso de la EHRN por mecanismo inmune ambas pruebas son positivas. IV. Protocolo: Objetivo de la práctica. Interpretar las reacciones de aglutinación. Determinación de los grupos ABO y Rh. Reactivos y Materiales. Antisueros anti-a, anti-b y anti-d. Portaobjetos. Lancetas de un solo uso. Algodón y alcohol etílico. 1. Se limpia el dedo con alcohol y algodón y se pincha con la lanceta. 2. Sobre un portaobjetos se depositan tres gotas de aproximadamente 0,5 cm de diámetro, bien separadas. 3. Sobre cada gota se adiciona el antisuero correspondiente con la pipeta Pasteaur y se mezcla con la punta de la misma durante unos segundos (OJO!! cada antisuero con una pipeta diferente). El orden recomendable es A, B y D. α-a α-b α-d 4. Determinar la aglutinación e interpretar el resultado. 5. Determinar la frecuencia de cada grupo en la clase y compararla con las frecuencias establecidas.

8 Fenotipos Individuos Frecuencia del grupo (%) Frecuencia poblacional (%) 0 45 A 40 B 11 AB 4 Rh+ 85 Rh- 15