Unidad9. Principios de Ingeniería Genética Aplicaciones de Biología Molecular

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1 Unidad9. Principios de Ingeniería Genética Aplicaciones de Biología Molecular Aislamiento, análisis y manipulación de ácidos nucleicos Generación de moléculas de DNA recombinante Ingeniería Genética AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA) Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes (para DNA) (detergentes, proteasas, cambios de presión) Separación del DNA del resto de los componentes celulares (principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas, solventes (fenol-cloroformo) Repetir la extracción. Eliminación del fenol. Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o isopropanol Disolver el DNA (Se concentra) Análisis del DNA 1

2 Análisis de Ácidos Nucleicos por Espectrofotometría Espectro de absorción de DNA Estimación de la concentración de A.N. por espectrofotometría A 260 = 1 50 µg/ml DNA dc 33 µg/ml DNA cs 40 µg/ml RNA También se mide la relación de abs. A 260 / A 280 => ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Separación en geles de agarosa (1 4%) Electroforesis horizontal. Migran al ánodo Tinción con bromuro de etidio Intercala entre las bases del DNA Forman complejos fluorescentes 2

3 Herramientas para el análisis de DNA. Enzimas de restricción y sus sitios de corte Son purificadas de bacterias Las enzimas de restricción son endonucleasas Rompen en sitios específicos del DNA Reconocen secuencias palíndromicas específicas de 4; 6 o 8 pb Algunas generan extremos romos y otros extremos cohesivos en el DNA al que cortan LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CORTAN DEJANDO EXTREMOS COHESIVOS STICKY DNA de un plásmido digerido con EcoRI DNA genómico digerido con EcoRI Extremos son compatibles Se aparean las bases de los extremos cohesivos y la DNA ligasa forma el enlace fosfodiéster entre la G y la A en ambas cadenas 3

4 VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS INSERCIÓN DE DNA FORÁNEO EN UN PLÁSMIDO (VECTOR) Corte del DNA con enzimas de restricción Ligación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector Plásmido DNA de interés Tratamiento con enzima de restricción Mezclar los fragmentos en presencia de una DNA ligasa Fragmentos de DNA con extremos cohesivos compatibles 4

5 CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICA Una biblioteca de DNA genómico es un conjunto de fragmentos de DNA de un organismo y empaquetados en vectores (plásmidos), que son mantenidos en células bacterianas. Digestión con enzimas de restricción DNA fragmentado y clonado en plásmidos Introducción de los plásmidos en bacterias TÉCNICAS DE HIBRIDIZACIÓN DEL DNA DESNATURALIZACIÓN-RENATURALIZACIÓN DNA de doble hélice Desnaturalización: se genera DNA de cadena sencilla Renaturalización: se forma DNA duplex 5

6 BÚSQUEDA DE UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA o DE cdna Membrana de nylon o nitrocelulosa Incubación con las sonda y lavado Colonias con el plásmido de interés Sonda: DNA de cadena sencilla marcado con 32 P Caja Petri con colonias de bacterias Se hace una réplica de las colonias en la membrana Lisis de las bacterias y desnaturalización del DNA con NaOH Exposición a un film fotográfico. Detección de colonias con el plásmido de interés. SÍNTESIS DE cdna y construcción de una biblioteca de cdna Selección del tejido Extracción de RNAm Hibridar con oligo-dt Síntesis de cdna con una transcriptasa reversa Eliminación del RNA Las transcriptasas reversas son enzima virales. Sintetizan DNA usando RNA como molde Síntesis de la segunda cadena de DNA 6

7 Transferencia en Southern Desarrollo de la Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Thermus aquaticus Taq DNA Polimerasa Great Fountain Geyser, Yellowstone. Manantial Temperatura C 7

8 El número de copias del fragmento de DNA aumenta exponencialmente 8

9 La reacción de PCR tiene múltiples aplicaciones Detección de alelos mutantes caracterizados. Búsqueda de alelos mutantes no conocidos. Identificación de microorganismos patógenos. Caracterización de cepas del virus de la influenza Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de cdna (Clonación de genes) Secuenciación de DNA Generación de mutantes puntuales. Estudiar la expresión génica. 9

10 10

11 La era genómica. Secuenciación de DNA La era genómica. Secuenciación de DNA 11

12 SECUENCIACIÓN DE DNA 12

13 Secuenciación de Genomas Aplicaciones de Biología Molecular Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la longitud de fragmentos de restricción) Diagnóstico genético. PCR Producción de proteínas recombinantes en bacterias Plantas genéticamente modificadas. Plantas transgénicas Terapia génica 13

14 Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la longitud de fragmentos de restricción) A lo largo del genoma de cada individuo hay diferencias sutiles en la secuencia del DNA. Estos cambios son de una sola base. Estos cambios pueden generar la formación de un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción por lo que el patrón de corte de una enzima de restricción para cada individuo va a ser único. Individuo 1 Individuo 2 Homocigoto Homocigoto Este es el fundamento de pruebas de paternidad. heterocigoto 14

15 Esta prueba también se utiliza en peritaje forense para obtener la huella genética Mancha de Sangre El DNA se extrae de las células sanguíneas Digestión del DNA con enzimas de restricción Se utiliza la técnica de Southern blot Sonda de DNA marcada se une específicamente Southern blot Los fragmentos de DNA se separan por electroforesis La membrana se lava y se revela para detectar bandas de interacción DNA-DNA El patrón de DNA se compara con el de sospechosos 15

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