Genética Medicina Nicolás Jouve Curso
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- Adrián de la Cruz Valdéz
- hace 7 años
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1 7. Los antecedentes metodológicos de los Proyectos Genoma. Historia del Proyecto Genoma Humano. Fundamentos y Objetivos. Metodología básica: corte de ADN, separación de fragmentos, clonación, librerías genómicas, ensamblado de cóntigosy secuenciación.las dos estrategias para el análisis de las secuencias: restricción a gran escala y secuencias de genes expresados. Docencia Fac. Medicina Genética Genómica = Conocimiento de organización = Mapas Los mapas genéticos tienen muchas utilidades: conocer los sistemas de organización de los genes, desarrollar sistemas de detección mediante técnicas moleculares, hacer diagnósticos de la presencia o ausencia de determinadas secuencias o genes. Realizar diagnóstico molecular encuentra sus aplicaciones en: genética clínica, genética forense, diagnósticos de paternidad, experimentos de transformación para terapia génica Genética N.Jouve 2 Linea germinal meiosis En la Meiosis se produce la «recombinación» Cada gameto, genéticamente diferente. La combinación genética que surge es diferente para cada gameto = Gametos: 22 + X ó 22 + Y (n = 23) = Gametos: 22 + X (n = 23) Fecundación: 22 + XX (2n = 46) 22 + XY(2n = 46) Soma mitosis adulto Genética N.Jouve 3 Los antecedentes metodológicos de los Proyectos Genoma 1900 (1865) El nacimiento de la Genética, (Mendel) (1869) El descubrimiento de que los genes, tienen su base química en el ADN El descubrimiento de la estructura de doble hélice del ADN El conocimiento del código genético universal El Dogma Central de la Biología Molecular La aparición de técnicas para aislar, clonar, y secuenciar el ADN Genética N.Jouve El código El Dogma genético Central universal de la Biología Molecular AGTGGCTATTCGACGCTATGCATTAAGCACGTATCGCATCGTA ADN (Gen) UCACCGAUAAGCUGCGAUACGUAAUUCGUGCAUAGCUAGCAU ARNm Núcleo Citoplasma Ser-Pro-Ile-Ser-Cys-Asp-Thr-STOP Proteína La aparición de técnicas para aislar, clonar y secuenciar el ADN 1978 W. Arber, D.Nathans, y H.O. Smith: Endonucleasas de restricción Las proteínas son el producto de los genes y forman Parte de estructuras ó funcionan como enzimas Genética N.Jouve P. Berg, F. Sanger y F. Gilbert: Ingeniería Genética Genética N.Jouve 6 1
2 La aparición de técnicas para aislar, clonar y secuenciar el ADN La aparición de técnicas para aislar, clonar y secuenciar el ADN Premios Nobel de 1980 por el desarrollo de un método eficaz para la secuenciación del ADN Virus o ADN Tamaño genoma Nº genes Año MS2 (ARN) b FX174 (ADNs) b SV40 (ADNd) pb Fago l (ADNd) pb Fago T (ADNd) pb Epstein-Barr (ADNd) pb ADN mit. humano (ADNd) pb Genética N.Jouve 7 Genética N.Jouve 8 Historia del Proyecto Genoma Humano Historia del proyecto genoma humano 1984 Reunión científica en Alta (California): conveniencia de poner en marcha un programa de gran envergadura y coste económico, para facilitar la detección de mutaciones génicas causantes de enfermedades Reunión en la ciudad de Santa Fe (California): se hizo la primera propuesta de un Proyecto Genoma Humano como requisito indispensable para comprender el cáncer. Genética N.Jouve 9 Genética N.Jouve 10 El orgullo nacional norteamericano está en juego: del mismo modo que en 1961 el Presidente Kennedy tomó la decisión de enviar un hombre a la luna, ahora la nación se ha comprometido a sí misma en un objetivo altamente visible e importante... Aunque el costo global de la secuenciación total del ADN humano será inferior en un orden de magnitud al de enviar al hombre a la luna, las repercusiones serán mucho más grandes. James Watson 1990 Genética N.Jouve Planteamiento y definición del Proyecto Lanzamiento del proyecto en EE.UU 1990 Internacionalización del Proyecto; establecimiento de una organización denominada HUGO (Human Genome Organization). Genética N.Jouve 12 2
3 NHGRI National Human Genome Research Institute (USA) *Baylor College of Medicine en Houston *Washington University School of Medicine en St. Louis *Whitehead Institute for Biomedical Res, Cambridge, MA Whitehead Institute, Boston NIH The National Institutes of Health (USA) DOE The Department of Energy (USA) *Joint Genome Institute in Walnut Creek, California Wellcome Trust *Sanger Centre, Hinxton (Inglaterra) Genética N.Jouve 13 CROM diciembre 1999 Eucromatina: kb CROM mayo kb Secuenciado: kb kb % terminado: 97 % % Nº de contigs: 12 6 Working draft 26 junio 2000 Genética N.Jouve de Febrero de 2001, la publicación en Nature y Science Secuenciada la primera bacteria Haemophilus influenzae genes (1.8 Mb Genética N.Jouve de abril de 2003 publicación en Science y Nature (50 aniversario del descubrimiento de la doble hélice). Genética N.Jouve 16 Objetivos del Proyecto Descifrar todo el mensaje del genoma humano Fundamentos y objetivos Desarrollar una tecnología eficiente para la secuenciación de todo el genoma Identificar variaciones alélicas (SNPs = single nucleotide polymorphisms). Interpretar las funciones: genómica funcional Descifrar y analizar las secuencias de organismos modelo (levadura, nemátodo, Drosophila y ratón) Genética N.Jouve 17 Genética N.Jouve 18 3
4 Examinar las Implicaciones Eticas, Legales y Sociales, ELSI, de la Investigación genómica Desarrollar herramientas de bioinformática y estrategias de computación para el uso de los datos de genes y secuencia Metodología básica Entrenamiento de científicos para la investigación y análisis de genomas Almacenar esta información en bases de datos Transferir tecnologías relacionadas al sector privado Genética N.Jouve 19 Genética N.Jouve 20 Metodología básica: técnicas de localización y detección, corte de ADN, separación de fragmentos, clonación, amplificación y secuenciación Dos estrategias para abordar el PGH Genética N.Jouve 21 Craig Venter A la caza de genes específicos Francis Collins Todo: genes y otras secuencias 22 Consorcio Internacional, Director Francis Colins. 6 pasos sucesivos: 1. Aislamiento del ADN genómico 2. Fragmentación 3. Clonación (mantenimiento de fragmentos) 4. Conservación de todos los fragmentos en librerías genómicas 5. Estudio del orden = cóntigos 6. Secuenciación de cada fragmento Genética N.Jouve Clonación 4 4. Librería genómica 2 2. Fragmentación 5 5. Mapa de cóntigos 1 1. Aislamiento ADN 1000 kb 6 6. Secuenciación Genética N.Jouve 24 4
5 2. Fragmentación Acción de las Endonucleasas Tipo II 3. Clonación Utilización de plásmidos (u otros vectores) romos cohesivos cohesivos cohesivos Genética N.Jouve 25 Genética N.Jouve Clonación Vector ADN donante Los vectores pueden ser plásmidos naturales, u otras formas modificados genéticamente. Tienen que tener capacidad de replicación. Ligasa de ADN Genética N.Jouve 27 Tipos Tamaño inserto Plásmidos -15 kb Fagos 20 kb Cósmidos 40 kb BACs kb YACs kb Genética N.Jouve Librerías genómicas Cada fragmento del genoma se inserta en un vector y cada vector se introduce en un cultivo bacteriano. 5. Ensamblado de cóntigos Supuestos 3 fragmentos A, B y C, se trata de encontrar su orden Relativo, mediante la búsqueda de regiones solapantes en los. Para ello se utilizan marcadores moleculares Cada cultivo conserva por replicación en las bacterias un fragmento distinto del genoma (clonación de fragmentos de ADN). Entre todos los cultivos deben completar de forma fragmentada Solapamiento Solapamiento El genoma completo. Su conservación constituye de este modo una librería genómica. Genética N.Jouve 29 Solapamiento La flecha señala un marcador (detalle de secuencia de ADN) común en B y C. Genética N.Jouve 30 5
6 4 Reacciones de síntesis de ADN que se interrumpen en una base dada (A, C, G ó T) seguido de la separación de los productos de síntesis por electroforesis Genética N.Jouve 31 Genética N.Jouve 32 TIPOS DE SECUENCIADORES AUTOMÁTICOS TERMINADORES (ddntps) MARCADOS FLUORESCENTEMENTE -REACCIÓN EN UN SOLO TUBO - UN SOLO CARRIL - CUALQUIER PRIMER - NO SE DETECTAN LAS PARADAS FALSAS (no se incorpora ddntp) GELES DE POLIACRILAMIDA CAPILARES CUATRO FLUOROCROMOS QUE EMITEN A DIFERENTES LONGITUDES DE ONDA CUATRO BASES DETECTADAS Y DISTINGUIDAS EN UN SOLO CARRIL O INYECCIÓN CAPILAR (5 -PRIMER; 3 -ddntp) 35 Genética N.Jouve 36 6
7 Sanger Center Celera Genomics, Director Craig Venter pasos sucesivos 1. Obtención de copias en versión ADN, ADNc, de ARN mensajeros de células especializadas. 2. Búsqueda en las librerías genómicas de los clones de los ADN copias anteriores. 3. Secuenciación del ADN de dichos clones. Genética N.Jouve 37 Genética N.Jouve 38 Clonación 4 5 Búsqueda de la secuencia del gen en Las librerías genómicas Células específicas 3 ADN c ARN pol 2 ARN-m Aislamiento de ARNm 1 Proteína Transcriptasa inversa Genética N.Jouve 39 7
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