Materia de Articulación CEBI_A5. Teórica 2 - Replicación del ADN

Transcripción

1 CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Articulación CEBI_A5 Biología Molecular l Teórica 2 - Replicación del ADN

2 La división celular requiere la duplicación del material genético

3 Genoma bacteriano genes en el genoma de E. coli

4 Genoma eucariota Cromosomas humanos Hay unos genes en el genoma humano, pero las variantes de splicing dan muchas más proteínas posibles

5 Compactación del genoma eucariota

6 Tres hipótesis sobre cómo ocurre la replicación del ADN El ADN marcado con N 15 se puede separar del marcado con N 14 por su densidad de

7 Melson y Stahl. La replicación del ADN es semiconservativa Bacteria cultivada en 15N como fuente de N (aa marcado). La generación 0 es pasada a 14N como fuente de N. Generacion 0 Generacion 1 Generacion 2

8 La replicación del ADN es semiconservativa

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10 Quién sintetiza el ADN? ADN polimerasa

11 La ADN polimerasa necesita ayudantes La ADN polimerasa SIEMPRE necesita un OH 3 libre sobre una ribosa para incorporar un nucleótido: se lo provee una ARN polimerasa llamada ADN primasa La separación delas hebras de ADN requiere aporte de energía: lo realiza una enzima llamada helicasa, que posee utiliza energía proveniente de la hidrólisis de ATP.

12 En las bacterias la polimerasa azanza a 500 nucleotidos por segundo. La helicasa genera una un continuo superenrollamiento en el ADN que es aliviado por una topoisomerasa

13 Superenrollamiento en una banda elástica

14 La replicación del ADN es semidiscontinua

15 La cadena retardada (lagging) forma un lazo

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17 Las polimerasas con actividad proofreading siempre son de ADN y siempre necesitan un primer Las polimerasas de ARN no necesitan primers y no tienen actividad proofreading, por lo que producen más errores que las de ADN Es por este motivo que los primers de los fragmentos de Okazaki son de ARN Estos primers de ARN tienen muchos errores, y por eso deben ser eliminados y reemplazados por ADN

18 La ADN polimersa no es perfecta, y es por eso que tiene actividad de corrección de errores

19 Cómo se originan los errores en la replicación del ADN?

20 Las mutaciones también pueden originarse por agentes físicos o químicos independientemente de la replicación del ADN Dímeros de timina en el ADN causados por la luz UV

21 Tautomerizacion de dguanosina inducida por alcalinización: ayuda a desnaturalizar el ADN, se usa en la purificación de plásmidos

22 Sistemas de correción de errores Actividad exonucleolitica de la polimerasa 3 -> 5 Actividad de reparación utilizando la hebra complementaria como molde. Depende de proteínas Mut, es posterior a la replicación y no depende de la ADN polimerasa

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24 Distintas ADN polimerasas cumplen diferentes funciones

25 ADN pol I ADN pol III ADN pol I

26 Las transcriptasas reversas de los retrovirus no cumplen el dogma de la biología molecular: transcriben ARN -> ADN HIV Herpes

27 La replicación del ADN se inicia en sitios específicos

28 Características de la Replicación Procariotas vs Eucariotas Es esencialmente similar en ambos Semiconservativa Origen único de replicación vs múltiples orígenes Origen: región definida vs. no definidos Bidireccional Semidiscontinua

29 Recombinación Reparación del ADN dañado Generación de crossing-overs en la meiosis (generación de gamentas)

30 Recombinación: mapeo por asociación de enfermedades humanas

31 La recombinación permite interrumpir un gen de manera selectiva para producir un organismo mutante

32 El ADN es incoloro, cómo lo veo? 2) Unión covalente a un fluoróforo 1) Colorante intercalante (unión no covalente) 3) Marcación con fósforo radiactivo

33 El bromuro de etidio fluoresce a la luz UV

34 Cómo separo moléculas de ADN de diferente tamaño? El ADN á id tá d El ADN por ser ácido está cargado negativamente al ph del interior de una célula (7)

35 Las moléculas de ADN se mueven hacia el polo + de un campo eléctrico a una velocidad inversamente proporcional a su tamaño

36 Una aplicación práctica de la replicación ió del ADN: su secuenciación ió Método de Sanger

37 Método de Sanger

38 Método de Sanger

39 Pirosecuenciación

40 Clonado de genes: para qué? Si quiero estudiar o vender una proteína necesito mucha cantidad, pero la mayoría de las proteínas son poco abundantes Si aislo el gen que codifica la proteína que Si aislo el gen que codifica la proteína que quiero expresar, puedo usar bacterias (o levaduras, etc.) como biofábricas para producirla en grandes cantidades

41 Dos herramientas simplificaron mucho el clonado de genes: La amplificación en cadena de la polimerasa (PCR) y La disponibilidad de secuencias de genomas completos

42 Amplificación en cadena de la polimerasa (PCR)

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44 Producción de bibliotecas de ADN genomico de de ADNc utilizando PCR

45 Algunos proveedores nacionales