ELISA (Enzime Linked Immunoassay): Bases Teóricas y Fundamentos Prácticos. Versión a utilizar en sesiones: 6 y 9

Transcripción

1 LIA (nzime Linked Immunoassay): Bases Teóricas y Fundamentos Prácticos Versión a utilizar en sesiones: 6 y 9

2 nsayo inmunoenzimático Definición: s una técnica que combina la especificidad de los anticuerpos con la sensibilidad de un ensayo enzimático. sta técnica es utilizada para medir tanto antígenos como anticuerpos, de manera cualitativa, semicuantitativa y cuantitativa

3 Las inmunoglobulinas: estructura y función

4 Antígenos e Interacciones Antígeno-anticuerpo Moléculas complejas extrañas al organismo, de naturaleza proteica que son capaces de inducir una RI y combinarse con los elementos efectores de la misma nlaces iónicos nlaces de hidrógeno Interacciones hidrofóbicas Fuerzas de van der Waals Interacciones dipolo-dipolo

5 Fases de las respuesta inmune humoral Abbas A, Inmunología celular y molecular 2000

6 FUNDAMNTO DL LIA Muestra Ag Ab Ag-Ab Ag-Ab Ab-nzima Fase ólida nzima unida al anticuerpo ubstrato Compuesto coloreado

7 LMNTO DL LIA Tipo de muestra Antígenos Anticuerpos Fase sólida nzimas Lavados ubstratos Lequin RM, Clin Chem, 2005; 51:2415 Revelador de la actividad enzimática

8 TIPO D MUTRA Orina aliva LCR uero Heces Otros

9 ANTÍGNO Completo (Organismo, estructura íntegra) xtracto total (Ultrasonido,solventes) Fracción Purificada (Núcleo, de membranas, organelas) Péptido sintético Fase sólida

10 ANTICURPO: Policlonales (infecciones naturales) Monoclonales Producción de Anticuerpos Monoclonales Inmunización de un ratón para estimular la producción de anticuerpos Células formadoras de anticuerpo aisladas del bazo Células tumorales crecen en cultivos tisulares Conjugado con la enzima Células formadoras de anticuerpo se fusionan con células tumorales cultivadas para formar un hibridoma e mide la producción de anticuerpos por los hibridomas e clonan las células de hibridoma productoras de anticuerpo e separan los anticuerpo monoclonales del cultivo Capturar antígenos

11 MATRIAL D LA FA ÓLIDA: oporte Nitrocelulosa Polivinilo Forma disponible Membranas, Láminas Placas, Láminas Unión No covalente Covalente Poliestireno Látex, nylon, celulosa Placas, Láminas, Perlas Láminas, Perlas Covalente Covalente

12 OLUCIÓN : D BLOQUO Buffer de bloqueo Caseína Caseína/Tween2 0 Composición 5% p/v leche sin grasa 5% p/v leche sin grasa, O,2 %de Tween20 Tween 20 O,2 %de Tween Gelatina BA Gelatina 0.2% (2mg/ml) Desventajas Deteriora rápidamente. nmascara algunos antígenos Deteriora rápidamente. nmascara algunos antígenos Podría generar algunos residuos 3% de BA, Relativamente costoso

13 istema de revelado de la reacción Ag-Ac: NZIMA 1. Alta pureza 2. Actividad específica 3. Bajo costo 4. Ausencia en fluidos biológicos 5. Fácil detección 6. Facilidad de conjugación 7. stabilidad a ciertas condiciones de almacenamiento

14 TIPO LA NZIMA NZIMA Peroxidasa Fosfata Alcalina β-galactosidasa Glucosa oxidasa Lisozimas Malato Deshidrogenasa ORIGN ubstrato Rabano picante OPD (Amarillo 492 nm) TMB (Amarillo 450 nm) schericia coli scherichia coli Aspergilus ninger Clara del huevo Corazón de Cerdo PNP(Amarillo) ONPG (Amarillo 410) Glucosa OPD (Anaranjado 490nm) (Campbell, 1991)

15 UBTRATO 1. Compuestos solubles 2. Fácil de manipular 3. No resulten tóxicos 4. Bajo costo Detección de la actividad nzimática Ácidos Fuertes Bases Fuertes

16 nsayo inmunoenzimático ensibilización de la placa Bloqueo de los espacios vacíos Incubación con la Muestra problema Incubación con l sistema de detección: j. i se busca IgG contra Ag del VIH, se trata con anti-igg humana conjugada con una enzima Adición del sustrato

17 Tipos de LIA DIRCTO INDIRCTO TIPO ÁNDWICH O CAPTURA D ANTÍGNO COMPTITIVO Antígeno Buffer de bloqueo Anticuerpo Anti-IG acoplada a una enzima ubstrato

18 Tipos de LIA INDIRCTO TIPO ÁNDWICH O CAPTURA D ANTÍGNO COMPTITIVO Antígeno Buffer de bloqueo Anticuerpo Anticuerpo acoplado a la enzima ubstrato

19 Tipos de LIA INDIRCTO TIPO ÁNDWICH O CAPTURA D ANTÍGNO COMPTITIVO

20 APLICACION Detección de antígenos o anticuerpos Virus Hongos Parásitos bacterias Detección de autoanticuerpos IgG (Factor reumatoideo) DNA Proteína del núcleon Tiroglobulina-Microsomales Complejos inmune

21 APLICACION Medición de Hormonas Progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, testosterona,, gonadotropina coriónica humana,th. Detección de antígenos tumorales: Antígeno prostático Alfa-fetoproteína fetoproteína Antígeno del ovario Antígeno carcinoembrionario