RESULTADOS Y DISCUSIÓN. Aislamiento de Inmunoglobulina de Conejo Anti-Ferritina

Transcripción

1 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Aislamiento de Inmunoglobulina de Conejo Anti-Ferritina El aislamiento de inmunoglobulinas provenientes del suero de conejo inmunizado con ferritina de bazo de caballo, se realizó mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz de Sefarosa-Proteína A, resina ampliamente reportada para el aislamiento de inmunoglobulina G (IgG) (Amersham Biosciences, 2001a; Amersham Biosciences, 2002). Tal cromatografía se basa en la capacidad de la proteína A de reconocer y unir específicamente a la fracción cristalizable (Fc) de la inmunoglobulina G (IgG) (Djuro y col., 2001; Amersham Biosciences, 2002). El cromatograma (Figura 2), muestra el comportamiento típico del aislamiento de IgG de conejo empleando la matriz de afinidad Sefarosaproteína A, donde se aplicó la muestra de 1 ml de suero conteniendo 44 mg de proteína sérica total. En la fracción de lavado están contenidas las proteínas no absorbidas o las unidas de forma inespecífica, estando dicha fracción enriquecida principalmente con albúmina. La fracción de elución permitió una recuperación de las inmunoglobulinas séricas de 16,6% obteniéndose en promedio, 7.1 mg de inmunoglobulinas séricas totales (Figura 2, pico 2). Las cantidades y porcentajes de recuperación cromatográfica se presentan en la Tabla II. Para evaluar la pureza de las fracciones de lavado y elución, se empleó SDS-PAGE al 12%, Figura 3. Este resultado muestra dos bandas principales, una de 59 kda y otra de 25 kda, las cuales corresponden a las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, respectivamente (Amersham Biosciences, 2001a; Djuro y col., 2001; Amersham Biosciences, 2002), este resultado nos permite confirmar que la cromatografía de afinidad Sefarosa- Proteína A muestra una fuerte especificidad para el aislamiento de las inmunoglobulinas de suero de conejo. 18

2 Figura 2. Cromatograma resultante de la Purificación de Inmunoglobulinas Anti-Ferritina de suero de conejo inmunizado. Se realizó una cromatografía de afinidad con la matriz Sefarosa-Proteína A, donde se cargaron 44 mg/ml de suero de conejo filtrado y cuantificado por UV. La fracción de lavado se realizó con PB 20 mm, ph 7.2. La fracción de elusión con glicina 20 mm, ph 2.6. Velocidad de flujo: muestra: 0.20 ml/min, corrida: 1 ml/min. 19

3 Tabla II. Porcentaje de recuperación de inmunoglobulinas de suero de conejo, cromatografía de proteína A. Muestra mg de Proteínas % de Recuperación Proteínas séricas de Conejo 44 Proteínas inespecíficas (fracción de lavado) Inmunoglobulinas (fracción de elución) % % Porcentaje total de recuperación de proteínas: % 20

4 Figura 3. Evaluación de la pureza de las fracciones de la cromatografía de hidrofobicidad (altamente acetilada) y de afinidad. Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en condiciones desnaturalizantes y reductoras. 21

5 La cromatografía de afinidad a Proteína A, no es la única reportada para el aislamiento de inmunoglobulinas con buenos porcentajes de recuperación y alto grado de pureza. Al igual que ésta, la cromatografía de hidrofobicidad (Porath y col., 19173) es un claro ejemplo de lo anterior, por lo que paralelamente utilizamos este método, para comparar el grado de rendimiento contra la cromatografía de afinidad de Sefarosa-Proteína A. Los resultados obtenidos de la cromatografía de hidrofobicidad se resumen en la Tabla III. El grado de pureza de la cromatografía de hidrofobicidad se determinó mediante SDS-PAGE al 12% (Figura 3). La cromatografía de interacción hidrofóbica ha sido utilizada por varios investigadores para la purificación de anticuerpos (Danielsson y col., 1988; Manzke y col., 1997; Amersham Biosciences, 2001b; Djuro y col., 2001), siendo de gran utilidad para la purificación selectiva de las subclases de la inmunoglobulina G humana (1gG) (Bridonneau y col., 1993; Manzke y col., 1997). En base a lo anterior, se comparó la cromatografía de hidrofobicidad con la cromatografía de afinidad Sefarosa-Proteína A, con el fin de analizar cuál ofrece mejor rendimiento. Como se muestra en la Figura 3, la cromatografía de afinidad generó una elusión con un mayor grado de pureza en comparación a la cromatografía de hidrofobicidad, probablemente debido a que la Proteína A reconoce específicamente la fracción cristalizable (Fc) de las Inmunoglobulinas, mientras la cromatografía de hidrofobicidad (AA) reconoce el carácter hidrofóbico de moléculas en general. Con ambas cromatografías se obtienen bandas de 59 y 26 KDa (Figura 3), masas correspondientes a la cadena pesada y ligera de las inmunoglobulinas respectivamente (Ahmadzadeh y col., 2011). Además, con la cromatografía de Sefarosa-proteína A, se obtiene una banda tenue con masa molecular con alrededor de 30 kda, y por otro lado en la cromatografía de HA se observan dos bandas con una masa 22

6 Tabla III. Porcentaje de recuperación del aislamiento de inmunoglobulinas de conejo, mediante cromatografía de hidrofobicidad. Muestra mg de Proteínas % de Recuperación Proteínas séricas de Conejo Proteínas inespecíficas (fracción de lavado) Inmunoglobulinas (fracción de elución) % % Porcentaje total de recuperación de proteínas: 77.4 % 23

7 molecular superior a los 95 kda, concordando estos resultados con lo reportado por la bibliografía, ya que tanto la cromatografía de afinidad de proteína A, como la HA, son útiles para el aislamiento de IgG (Manzke y col., 1997; Djuro y col., 2001; Amersham Biosciences, 2001a; Amersham Biosciences, 2002). El porcentaje de recuperación de ambas cromatografías es muy similar, siendo de 80% mediante cromatografía de hidrofobicidad y 77.5% por cromatografía de afinidad a proteína A. Para fines de este trabajo se seleccionó la cromatografía de afinidad Sefarosa-proteína A, por obtener un mayor grado de pureza al ser analizado por electroforesis (Manzke y col., 1997; Djuro y col., 2001). Aislamiento de Ferritina Sérica Humana, Mediante Cromatografía de Afinidad con Anticuerpos Una vez aislados los anticuerpos específicos a ferritina, éstos fueron acoplados a una resina de Agarosa para generar la matriz de Agarosa-Anti-Ferritina (Worwood y col., 1981; Persson, 1987; Harrison y col., 1996). Los resultados obtenidos se muestran en el cromatograma de la Figura 4, donde se puede apreciar fácilmente la fracción de lavado (pico 1) que incluye proteínas no unidas y las reconocidas inespecíficamente, y la fracción de elusión (pico 2), donde la ferritina sérica se encuentra enriquecida. Los resultados de esta cromatografía se resumen en la Tabla IV, la cual indica que el porcentaje total de recuperación de proteínas es del 50.1%. Sin embargo, a pesar de tener un porcentaje bajo de recuperación, comparado con los métodos previamente descritos (referencias) este método presenta la ventaja de ser rápido, siendo su tiempo de realización de 2.5 h en promedio, y comparado con el método de referencia llevado a cabo por Worwood y col. (1981), que se realiza en tiempo más prolongado y con un volumen de muestra mayor, nuestro método es una alternativa viable para su obtención (Wordwood y col., 1981; Amersham Biosciences, 2001a). 24

8 Figura 4. Cromatografía de afinidad empleando IgG de conejo inmunizado con ferritina de bazo de caballo. Vol. de cama: 2.9 cm 3, muestra: suero humano 70.5 mg/ml, filtrado y cuantificado por UV. Lavado: PB 20 mm, ph 7.2. Elusión: Glicina 20 mm, ph 2.6. Velocidad de flujo: muestra: 0.20 ml/min y corrida: 1 ml/min. 25

9 Tabla IV. Porcentaje de recuperación de la cromatografía anti-ferritina. Muestra mg de Proteína % de Recuperación Suero Humano 70.5 Proteínas inespecíficas (fracción de lavado) Proteínas especificas (fracción de elución) % 26

10 En base a los resultados obtenidos, la cromatografía de afinidad Sefarosa-Anti-Ferritina cae dentro de la categoría de regular (Amersham Biosciences, 2001a). La obtención de la elusión en un solo tubo puede deberse a la interacción específica entre las proteínas del suero problema, principalmente ferritina y la matriz, bajo las condiciones aquí ensayadas, lo que genera que la técnica se realice en un menor tiempo y un menor volumen recolectado (Amersham Biosciences, 2001a). Así mismo, es importante mencionar que los niveles normales de ferritina sérica son de 50 a 300 ng/ml, por lo tanto resulta complejo estandarizar el proceso de purificación y/o aislamiento de esta molécula dadas las bajas concentraciones en que se encuentra en circulación. Para evaluar la pureza de las fracciones de lavado y elusión de la cromatografía de afinidad con anticuerpos, se realizaron corridas electroforéticas. En la Figura 5 se muestra el perfil proteico en SDS-PAGE al 12%, observándose en el carril de elusión, 6 bandas con masas estimadas entre 80 y 24 kda, siendo la banda de 24 kda la que correspondería, según lo reportado por la literatura, a la subunidad ligera de ferritina sérica en su forma glicosilada (Worwood y col., 1990; Harrison y col., 1996; Koorts y col., 2007; Arosio y col., 2008). En la fracción de lavado se observa una gran cantidad de bandas que corresponden a las proteínas no unidas o unidas inespecíficamente a la matriz cromatográfica, predominando la banda característica de albumina de 66 kda (Stewart y col., 2003). Es importante mencionar que la gran mayoría de las proteínas se observan en la fracción de lavado y que solamente seis bandas se logran apreciar en la fracción de elusión, lo cual nos indica que son relativamente pocas las proteínas que interaccionan con la matriz que se esta probando (Roy y col., 2000). 27

11 Figura 5. Electroforesis SDS- PAGE 12%. De izquierda a derecha, Carril no. 1 Fracción (Fx.) de Elusión de la cromatografía de IgG de conejo inmunizado con ferritina de bazo de caballo. Carril No. 2 Marcador de peso molecular (PM). Carril 3 y Fx. de lavado de cromatografía de IgG 28

12 La ferritina sérica difiere de la intracelular debido a que presenta modificaciones postraduccionales tales como la glicosilación (Woorwood y col., 1981; Santambrogio y col., 1987; Vignes y col., 2000). La banda que se localiza a la altura de 79 kda, podría corresponder a transferrina, la cual presenta una masa molecular de alrededor de 80 kda (Stewart y col., 2003), y se ha reportado que dicha molécula puede dar reacción cruzada con ciertas inmunoglobulinas de conejo (Djuro y col., 2001). Sin embargo, para poder afirmar lo anterior es preciso llevar a cabo experimentos más específicos, como una inmunodetección (western blot), lo cual no es el objeto del presente trabajo. Por otro lado, en la Figura 6 se muestra el perfil proteico resuelto en PAGE al 8% en condiciones nativas. En la fracción de elusión se observan dos bandas, una banda a la misma altura que la presente en el carril de ferritina comercial, alrededor de los 450 kda, además de otra banda de masa molecular inferior. Por otro lado, en la fracción de lavado se observa una gran cantidad de bandas, correspondientes a proteínas inespecíficas. Este resultado es congruente con lo descrito en SDS-PAGE al 12%, en donde la fracción de lavado muestra el mayor número de bandas si se compara con la fracción de elusión, donde al encontrarse una banda a la misma altura que la ferritina comercial y a la altura de 24 kda en SDS-PAGE, indica que probablemente es ferritina sérica la que se aprecia en ambos geles (Worwood y col., 1981; Vignes y col., 2000; Parthasarathy y col., 2002; Arosio y col., 2008), al mismo tiempo, el perfil electroforético de las fracciones de elusión en ambas corridas electroforéticas indican que son pocas las proteínas que interaccionan con la matriz cromatográfica. Estos resultados muestran un claro aislamiento de ferritina sérica (Hage y col., 1999). 29

13 Figura 6. Evaluación de la pureza de las fracciones de la Cromatografía de Afinidad con Anticuerpos Policlonales Anti-Ferritina. Se realizó una PAGE al 8% en condiciones nativas. En el carril de la Fx. de Elución, flecha 1, banda a la misma altura que la observada en la ferritina comercial, flecha 2, banda con peso molecular inferior a 450 kda. 30

14 Determinación Cuantitativa de Ferritina Sérica Las fracciones de lavado y elusión de la cromatografía de agarosa-antiferritina se cuantificaron mediante un kit comercial. La concentración de ferritina sérica del suero problema fue de ng/ml, ng/ml de la fracción de lavado y 6.20 ng/ml en la elusión, lo que indica un porcentaje de recuperación de ferritina sérica de 5.07%. Nuestros resultados están por debajo de lo reportado para una cromatografía de afinidad con anticuerpos policlonales, ya que se reporta de un 8 a 15% (Subramanian, 2000). Aunado a lo anterior, estos resultados se encuentran también por debajo de lo reportado en el estándar de oro para la purificación de ferritina sérica, el cual muestra un porcentaje de recuperación de ferritina de alrededor de 15-20% (Worwood y col., 1981). Estos resultados pueden ser atribuibles a varios factores, tales como el hecho de que Worwood utilizó anticuerpos contra ferritina humana, mientras que en el presente trabajo se utilizó ferritina de bazo de caballo como inmunógeno. Este factor influye ya que aun cuando se ha comprobado el reconocimiento de IgG policlonales anti-ferritina de bazo de caballo, existe una homología entre la ferritina de bazo de caballo y ferritina sérica humana de alrededor del 95%; dentro del 5% restante, se pueden encontrar los posibles epítopes inmunodominantes, disminuyendo así el reconocimiento hacia ferritina humana (Harrison y col., 1996). Otro posible factor contribuyente a la pobre recuperación de ferritina sérica, puede ser el hecho de que no se realiza un pretratamiento del suero, lo que pudiera tener impedimentos mecánicos hacia los sitios de reconocimiento de los anticuerpos; tal ambiente obstaculizante se puede generar por la alta concentración de otros analitos presentes en la muestra de trabajo (Lipman y col., 2011). Finalmente, otro factor que podría contribuir a la pobre recuperación de ferritina sérica colectada, es la síntesis de la matriz, ya que es posible que en este procedimiento no se utilizara un brazo espaciador adecuado, impidiéndose con ello un correcto reconocimiento entre ferritina sérica y el 31

15 anticuerpo policlonal (Vignes y col., 2000; Arosio y col., 2008; Amersham Biosciences, 2001a). 32