ELECTROFORESIS GENERALIDADES Y APLICACIONES CLINICAS
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- Vicente Maestre Suárez
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1 ELECTROFORESIS GENERALIDADES Y APLICACIONES CLINICAS Marcelo Castillo Navarrrete, T.M. MsCs (C) Facultad de Medicina Carrera Tecnología Médica 18 de Noviembre de 2004
2 Fundamentos de Electroforesis Alta sensibilidad, resolución y versatilidad. Método de separación de Ácidos nucleicos Proteínas Otras biomoléculas Entrega criterio de pureza. Separa mezclas complejas Permite determinar El peso molecular de una proteína Punto isoeléctrico. Número de cadenas polipeptídicas de una proteína
3 Fundamentos de Electroforesis Migración de solutos en un campo eléctrico. Se mueven las partículas en base a: Su carga neta. Peso molecular Estructura tridimensional
4 Fundamentos de Electroforesis La velocidad de migración (V) de la partícula es directamente al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial eléctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de fricción (f) relativo a la talla y forma de la molécula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio V = qe/f
5 Fundamentos de Electroforesis La Movilidad electroforética (Me) Es un caso particular de la migración de un ión. En un campo eléctrico de 1V/cm Su signo es igual al de la carga de la partícula. La velocidad de Migración electroforética Carga de la molécula Voltaje aplicado Exceso de voltaje = Incremento del calor. Bajo voltaje = pobre separación (por difusión) Porosidad del gel
6 Fundamentos de Electroforesis Las biomacromoléculas. Poseen carga eléctrica. Grupos catiónicos y aniónicos disociables. La carga neta de una molécula ph del medio La interacción con otras pequeñas moléculas de iones. La interacción con otras macromoléculas.
7 Fundamentos de Electroforesis La carga neta de una molécula (2) El ph influye en la migración de una molécula En el punto isoeléctrico, la proteína no migra. Por debajo del pto. Isoelectrico migra hacia el cátodo. Por encima del pto. Isoeléctrico migra hacia el ánodo.
8 ADN PROTEINAS
9 Fundamentos de Electroforesis Los soportes usados Polímeros Gel poroso Restringe el movimiento de las moléculas Disminuyen los flujos de convección del solvente. Se han usado como soporte Papel (celulosa) Almidón Poliacrilamida Agarosa Acetato de Celulosa
10 CELULOSA ALMIDON POLIACRILAMIDA AGAROSA
11 Fundamentos de Electroforesis La electroforesis presenta gran poder resolutivo Pequeña cantidad de proteína Zona estrecha (carril) Gran longitud de trayecto (longitud del carril).
12 Fundamentos de Electroforesis Equipamiento necesario. Fuente de poder, Cubeta vertical u horizontal. 2 electrodos Actualmente existen sistemas automatizados de electroforesis.
13 Electroforesis en gel de La poliacrilamida: Soporte empleado frecuentemente ( %) Químicamente inerte poliacrilamida
14 Electroforesis en gel de poliacrilamida La poliacrilamida: De propiedades uniformes Geles transparentes Estabilidad mecánica Insolubles en agua Relativamente no iónicos Rango pequeño de separación Alta resolución El tamaño del poro, varía de manera uniforme con la cenctración del gel. De preparación rápida, pero trabajosa Reproducible
15 Electroforesis en gel de Formación del gel Polimerización vinílica monómero de acrilamida (CH 2 =CH- CO-NH 2 ) Potente neurotoxina Monómero entrecruzador N,N - metilen-bis-acrilamida (CH 2 =CH-CO-NH-CH 2 - NH-CO-CH=CH 2 ) poliacrilamida
16 Formación del gel Se inicia Electroforesis en gel de poliacrilamida formación de radicales libres del monómero Que producen radicales libres del oxígeno Por acción de iones persulfato. Las aminas terciarias (N,N,N,N - tetrametilen-diamina, TEMED) Catalizadores de la reacción Formación de radicales libres del persulfato Se inhibe fuertemente por niveles altos de Oxígeno.
17 Electroforesis en gel de poliacrilamida Separación electroforética Función importante: ph Fuerza iónica Gradiente de potencial Tiempo de corrida Concentración de acrilamida y bisacrilamida Las condiciones óptimas Determinadas experimentalmente
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19
20 Electroforesis en gel de agarosa Polisacárido extraido de algas marinas Usado de 0.5 2% Geles fáciles de preparar No es tóxico Amplio rango de separación Baja resolución Usado típicamente para ADN
21 Electroforesis de proteínas En clínica plasmáticas se usa normalmente acetato de celulosa Soporte Inerte Se lee en un fotodensímetro Dibuja un trazado de absorbancia Se obtiene una curva El proteinograma Permite orientación rápida y clínicamente significativas
22
23
24 MIELOMA MULTIPLE
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26
27 GAMAPATIAS MONOCLONALES
28 REACTANTES DE FASE AGUDA
29 ENFERMEDAD HEPATICA
30 PATRON ELECTROFORETICO EN ENFERMEDADES GASTROINTETINALES PT ALB. Alfa1 Alfa2 Beta Gamma Ulcera Péptica D D Puede estar A Puede estar A Colitis Ulcerosa D D Puede estar A Puede estar A D Enteropatía perdedora de proteínas D Notable A A D Hepatitis vírica aguda D, N D D(indica lesión hepatocelular aguda) D D V, A
31 ELECTROFORESIS GENERALIDADES Y APLICACIONES CLINICAS Marcelo Castillo Navarrrete, T.M. MsCs (C) Facultad de Medicina Carrera Tecnología Médica 18 de Noviembre de 2004
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