CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

Transcripción

1 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN Curso: Química Analítica II Loreto Ascar 2012 Esquema de las bases de la separación en cromatografía de: (a)absorción, (b) partición, (c) Intercambio iónico y (d) Exclusión por tamaño 1

2 CROMATOGRAFÍA DE REPARTO El líquido de la fase estacionaria está adsorbido sobre un soporte sólido. Los líquidos que componen ambas fases deben ser inmiscibles Cromatografía líquido líquido (adsorción física de la fase estacionaria sobre el soporte) Desventaja: Pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase móvil, no permite trabajar en gradiente Cromatografía de fase unida químicamente o enlazada (unión química de la fase estacionaria sobre el soporte) Fase Estacionaria Sílice hidrolizada R es un grupo alquilo o alquilo sustituido, le confiere carácter polar o apolar: Polares: Fase Normal Apolares: Fase Reversa ciano(( C 2 H 4 CN) cadenahidrocarbonada diol( C 3 H 6 OCH 2 CHOHCH 2 OH) n-octyl(c 8 ) amino ( C 3 H 6 NH 2 ) n-octyldecyl(c 18 ) Fases estacionarias polares 2

3 Fases estacionarias apolares Octadecil: Si-O-Si CH 3 Octil: Si-O-Si CH 3 Dimetil: Si-O-Si -CH 3 CH 3 El enlace covalente, le confiere carácter térmico e hidrolítico estable Partícula de relleno para (a) cromatografía en fase normal y (b) cromatografía en fase reversa Rellenos de Fase Normal y Fase Inversa Fase Normal Fase estacionaria: polar Fase móvil: apolar Fase Inversa Fase estacionaria: apolar Fase móvil: polar 3

4 Fase Normal y Fase Inversa Efecto largo de cadena en fase inversa Partículas de 5 µm, fase móvil 50/50 : metanol/agua, caudal 1,0 ml/min Elección del Método Cromatográfico Debe existir un adecuado equilibrio entre las fuerzas intermoleculares del soluto, fase móvil y fase estacionaria Soluto muy afín con fase móvil, tiempo de elución muy bajo, pobre separación Soluto muy afín con fase estacionaria, tiempo de elución excesivamente largo Polaridad grupos funcionales: Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes 4

5 Acetaminofen, cafeína, ácido benzoico y ácido salicílico Aplicaciones de la cromatografía de reparto 5

6 Derivatización Reducir la polaridad de los analitos, poder usar cromatografía de reparto Aumentar la respuesta del detector (sensibilidad) Aumentar la selectividad del detector CROMATOGRAFÍA DE PARES IÓNICOS (ICP) Permite la determinación de especies iónicas por cromatografía de reparto en fase inversa, incorporando un contraión a la fase móvil de carga opuesta al analito, generando una especie neutra. La fase móvil está constituida por una disolución acuosa reguladora que contiene un disolvente orgánico como metanol o acetonitrilo y un compuesto iónico que aporta un contra ión de carga opuesta al analito, generando una especie neutra que es retenida por el relleno de fase inversa. Mecanismos para la separación por cromatografía de pares iónicos Formación de pares iónicos del contraión con la muestra ionizada, para formar la especie neutra que luego va a interactuar con la fase estacionaria. La cadena alquílica del contraión se reparte en la fase estacionaria dejándola cargada, esto convierte la columna de fase inversa en una columna iónica. 6

7 CROMATOGRAFÍA CON FASES ESTACIONARIAS QUIRALES Es una metodología que permite la separación de isómeros ópticamente activos (enantiómeros) Se recubre el soporte con un polímero al cual se le enlaza un isómero ópticamente activo CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN Cromatografía líquido- sólido Fase estacionaria: altamente polar (Sílice o alúmina) Fase móvil: relativamente no polar Es adecuada para compuestos no polares de masas moleculares inferiores a 5000 Hidrocarburos aromáticos, haluros, aldehídos, sulfuros, éteres, ésteres, cetonas, alcoholes SELECCIÓN DE LA FASE MÓVIL Para optimizar las separaciones sólo se puede modificar la composición de la fase móvil En la cromatografía de adsorción hay dos procesos competitivos involucrados: Reacciones entre el grupo funcional del soluto y los sitios de enlace de la fase estacionaria. Competencia entre la fase móvil y las moléculas del soluto porlossitiosdeenlacedelafaseestacionaria 7

8 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO (cromatografía en geles o filtración en geles) La cromatografía de exclusión por tamaño, consiste en una fase estacionaria de geles con tamaño de poro controlado. Los componentes de la muestra se separan de acuerdo al tamaño de sus moléculas Rellenos de columna Pequeñas partículas poliméricas o de sílice (5 a 10 umde tamaño), con una red de poros uniformes en los que pueden difundir las moléculas de soluto y el disolvente 8

9 Rellenos de columna Teoría de la cromatografía de exclusión por tamaño La curva de calibración se realiza con estándares. Cromatograma de exclusión de una mezcla de seis ácidos débiles 9

10 Proteínas Cromatografía de intercambio iónica o cromatografía iónica (IC) Separación y determinación de iones utilizando resinas de intercambio iónico. Utiliza como fase estacionaria una resina y como fase móvil un disolvente Los intercambiadores catiónicos contienen ácido sulfónico. Los intercambiadores aniónicos contienen grupos amino cuaternarios N(CH 3)3+ OH- o grupos amina primaria -NH3+ OHlos primeros son base fuerte y los segundos base débil. Intercambiadores catiónicos: xrso 3- H + +M X+ <--->(RSO 3- ) x M X+ +xh + sólido disol. sólido disol. RSO 3- H + :grupos deac.sulfónicounidos aunagranmolécula polimérica. Intercambiador aniónico: RN(CH 3 ) + OH - + A X- <----> RH (CH 3- ) A x- + x OH - solido disol sólido disol 10

11 Rellenos de Intercambio Iónico Partículas esféricas porosas producidas por la polimerización de estirenocon divinilbenceno, actualmente se utilizan partículas esféricas no porosas Rellenos de Intercambio Iónico Resinas de intercambio catiónico: ácido sulfónico(-so 3- H +, ácido fuerte) ácido carboxílico (-COO-H+, ácido débil) Resinas de intercambio aniónico: grupos amino cuaternarios ( N(CH 3 ) 3 + OH -, base fuerte) grupos amina primaria ( -NH 3 + OH -,base débil) 11

12 Cationes y metales de transición Aplicaciones 12

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