Cromatografía de alta presión: esquema
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- Lidia Vázquez Bustamante
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1 Cromatografía de alta presión: esquema Registrador Bomba Inyector Medidor de presión Reservorio de solventes Sistema de datos o integrador Columna Detector Desecho HPLC 2 10/96 1
2 PROPIEDADES DE LA FASE MÓVIL Disuelve la muestra k' de 2-10 Alta pureza Costo, viscosidad, toxicidad, punto de ebullición HPLC 2 10/96 2
3 SISTEMAS DE SOLVENTES TÍPICOS FASE NORMAL hexano, cloruro de metileno, cloroformo, metanol, acetonitrilo FASE REVERSA - metanol/agua, acetonitrilo/agua INTERCAMBIO IÓNICO - buffer acuoso PERMEACIÓN EN GEL - tetrahidrofurano, tolueno, cloroformo HPLC 2 10/96 3
4 FILTRACIÓN DE LA FASE MÓVIL A VACÍO DISOLVENTE FILTRO DE 2 m HPLC 2 10/96 4
5 RAZONES PARA FILTRAR PARTÍCULA FUGA PARTÍCULA PISTÓN VÁLVULA CHECK ARAÑAZOS BOMBA Filtrar el disolvente es esencial en HPLC! HPLC 2 10/96 5
6 FILTRACIÓN DE LA MUESTRA Émbolo 10ml jeringa 0.5 m Filtro Malla de soporte Filtro HPLC 2 10/96 6
7 REQUISITOS DE LAS BOMBAS 1. Químicamente inerte 2. Alta presión (5,000 PSI) 3. Flujos ( ml/min) 4. Libre de pulsos o amortiguada 5. Reproducibilidad de flujo <1.0% 6. Gradiente, cambio rápido de disolvente HPLC 2 10/96 7
8 Materiales de construcción /compatibilidad con disolventes Completamente resistentes: Teflón, Rubí, Zafiro, Cerámica, Tefzel, Kalrez, Fluoraz Resistencia limitada: Acero Inox. 316 Cloruros acuosos ácidos PEEK Ácidos nítrico o sulfúrico conc. Kel-F disoluciones de THF, hidrocarburos halogenados Acetal Ácidos o bases fuertes HPLC 2 10/96 8
9 TIPOS DE BOMBAS Pistón reciprocante (las más comunes) Pistón reciprocante de doble cabeza Bombas de jeringa (más empleadas en SFC y micro HPLC) HPLC 2 10/96 9
10 Bombas de pistón reciprocante Reservorio externo Motor Cam Cámara hidráulica Pistón Valvulas Check HPLC 2 10/96 10
11 Bombas de pistón reciprocante de doble cabeza Mejor estabilidad de flujo que las de una cabeza......produce una línea base más estable HPLC 2 10/96 11
12 VALVULAS CHECK DE HPLC A la columna Válvula de bola de salida Pistón Válvula de bola de entrada Del reservorio HPLC 2 10/96 12
13 BOMBAS DE PISTÓN RECIPROCANTE VENTAJAS Baratas 6000 psi Reservorio externo LIMITACIONES Ruído de pulso Mantenimiento, sello de las válvulas Diseño mecánico simple HPLC 2 10/96 13
14 BOMBAS DE JERINGA MOTOR PISTÓN DISOLVENTE GUÍA Y ENGRANE SELLOS HPLC 2 10/96 14
15 20 ELUCIÓN ISOCRÁTICA vs. GRADIENTE % Solvente B % Solvente B TIEMPO TIEMPO En HPLC Isocrático, la composición de la fase móvil permanece igual durante el análisis En HPLC Gradiente, la fuerza de la fase móvil se incrementa con el tiempo de análisis. HPLC 2 10/96 15
16 COMPARACIÓN DE ELUCIÓN ISOCRÁTICA Y GRADIENTE BIFENILOS CLORADOS 50% Metanol 50% Agua % MeOH / 80% H 2 O a 75% MeOH / 25% H 2 O min min ELUCIÓN ISOCRÁTICA ELUCIÓN GRADIENTE HPLC 2 10/96 16
17 FORMACIÓN DE GRADIENTES A ALTA PRESIÓN 0.4 ml/min 0.9 ml/min A Bomba 40:60 90:10 Bomba Programador Programador B Bomba Cámara Mezclado Bomba 0.6 ml/min 0.1 ml/min De 40%A - 60%B a 90%A - 10%B HPLC 2 10/96 17
18 FORMACIÓN DE GRADIENTES A BAJA PRESIÓN Reservorios de disolventes A B C Programador Válvula Multipuertos Cámara de Mezclado A LA BOMBA DE HPLC HPLC 2 10/96 18
19 OPERACIÓN VÁLVULA DE INYECCIÓN A LA COLUMNA DE LA BOMBA RIZO DE MUESTRA JERINGA CARGA INYECCIÓN HPLC 2 10/96 19
20 ARREGLO DE PRE-COLUMNA Y GUARDA-COLUMNA BOMBA PRECOLUMNA GUARDA- COLUMNA VÁLVULA DE MUESTREO COLUMNA ANALÍTICA DETECTOR HPLC 2 10/96 20
21 CONEXIONES PARA HPLC "X" Distance "X" is critical in obtaining a low-volume, leak-free seal "X" is too long: leaks inevitable 2. "X" is too short: adds to extracolumn volume WATERS.080 UPCHURCH WATERS UPCHURCH PARKER.090 SWAGELOK.170 VALCO SWAGELOK VALCO RHEODYNE PARKER RHEODYNE...and varies greatly from one manufacturer to another. WATERS UPCHURCH PARKER HPLC 2 10/96 21
22 CONSTRUCCIÓN DE COLUMNAS DEL INYECTOR 2 m FRITADO POROSO AL DETECTOR LARGO: 3, 5, 10, 15, 25, cm I.D.: 4 or 4.6 mm ACERO INOXIDABLE partículas 3, 5, 10 m HPLC 2 10/96 22
23 COLUMNAS CARTUCHO CARTUCHO HPLC 2 10/96 23
24 LC ANALÍTICA vs. LC SEMI-PREP ANALÍTICA SEMI-PREPARATIVA MUESTRA : 0.1 mg in 10 µl 50 mg in 2 ml COLUMNA : 4.6 x 150 mm 10 x 250 mm FLUJO : 1 ml/min 10 ml/min DETECTOR : Alta sensibilidad, PDA Baja sensibilidad, RI HPLC 2 10/96 24
25 CONTROL DE TEMPERATURA EN HPLC TERMOSTATADO DE COLUMNA Áreas de pico y tiempos de retención más reproducibles. CALENTAMIENTO DE COLUMNA : 1. Menor viscosidad, menos presión. 2. Menor coleo de pico, desorción más rápida. 3. Usualmente menor selectividad. HPLC 2 10/96 25
26 EFECTO DEL CONTROL DE TEMPERATURA EN LA SEPARACIÓN 40 C 65 C min HPLC 2 10/96 26
27 DETECTORES DE HPLC DETECCIÓN ULTRAVIOLETA (UV) Longitud de onda fija Longitud de onda variable Arreglo de diodos INDICE DE REFRACCIÓN FLUORESCENCIA ELECTROQUÍMICA MS / FTIR / Conductividad/MS HPLC 2 10/96 27
28 SISTEMAS DE DATOS INTEGRADORES. Fácil de usar. Precio moderado COMPUTADORA. Flexible, poderosa. Cara HPLC 2 10/96 28
29 CROMATOGRAMA DE INTEGRADOR * RUN# 523 FEB 16, :44:11 START STOP RUN# 523 FEB 16, :44:11 SAMPLE# 2 AREA% RT AREA TYPE WIDTH AREA% VB BB PV VB BB BB BB BB TOTAL AREA=1.3523E+07 MUL FACTOR=1.0000E+00 HPLC 2 10/96 29
30 VALORES TÍPICOS PARA HPLC COMPONENTE VALOR TÍPICO INTERVALO EMPAQUE Tamaño partícula 10 y 5 m 3-10 m Tamaño de poro 80 y 100 Å Å, hasta 4,000 Å COLUMNA Diámetro Int. 4.6 mm 2-5 mm Largo 15 y 25 cm 3-30 cm BOMBA Presión 1500 psi psi Flujo Volumétrico 1 ml/min ml/min Flujo lineal 0.1 cm/sec cm/sec MUESTRA Volumen 20 l l Concentración 0.1 % 1 ppm - 1 % DETECTOR Volumen de celda 5 l 2-15 l to 200 l Constante de tiempo 50 msec 25 msec - 1 sec HPLC 2 10/96 30
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