Moléculas pequeñas: Cromatografía: Cromatografía: CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI

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1 Moléculas pequeñas: CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Articulación CEBI_E1a Técnicas de Análisis en Biotecnología Moléculas Pequeñas Docente a cargo: Marianela SANCHEZ msanchez@qo.fcen.uba.ar CEBI_E1a Compuestos orgánicos de bajo peso molecular (<800 Da, no poliméricos) Variedad de funciones biológica: Comunicador celular, Drogas Pesticidas Pueden ser naturales (metabolitos secundarios) o artificiales (sintéticos) M. Sánchez-CEBI_E1a 2 Muestreo y análisis de las materias primas Análisis de productos intermedios Técnicas cromatográficas: HPLC CG Espectroscopía de RMN Espectrometría de Masas Monitorización de la calidad de los productos Monitorización de la calidad de los efluentes M. Sánchez-CEBI_E1a 3 M. Sánchez-CEBI_E1a 4 Cromatografía: Técnica que permite separar los diferentes componentes de una mezcla compleja. La separación se logra por diferencias en la movilidad relativa de los solutos (interacciones físicas y químicas entre los componentes). Cromatografía: Fase estacionaria Fase móvil Soluto o muestra M. Sánchez-CEBI_E1a 5 M. Sánchez-CEBI_E1a 6

2 Cromatografía: Se pueden clasificar: De acuerdo al soporte Al tipo de equilibrio que se establece en la separación Al estado de agregación de la fase móvil Cromatografía: Constante de distribución(kc)= relaciona la concentración de un soluto entre la fase móvil y la estacionaria. Kc = Cs Cm Concentración del analito en fase móvil Concentración del analito en fase estacionaria M. Sánchez-CEBI_E1a 7 M. Sánchez-CEBI_E1a 8 Durante la migración de la muestra a través de la FE se produce la separación de los componentes. Factor de retención (k) = permite comparar la velocidad de migración de los diferentes solutos. Se puede determinar experimentalmente. k= Tr Tm Tm IMPORTANTE: k <<<<< a 1 soluto muy poco retenido k entre 1 y 5 valor ideal k 20 o mayor cromatografías muy largas M. Sánchez-CEBI_E1a 9 M. Sánchez-CEBI_E1a 10 Ensanchamiento de banda: dispersión Caminos múltiples Empaquetamiento Rango de tamaño de partícula Diámetro de partícula Dispersión Ensanchamiento a flujos bajos M. Sánchez-CEBI_E1a 11 M. Sánchez-CEBI_E1a 12

3 Dispersión Transferencia de masa Ecuación de van Deemter: Difusión del analito dentro y fuera de la FM estancada en el poro de la FE. Multiplicidad de caminos Difusión longitudinal Transferencia de masa Diferentes profundidades de penetración causan diferentes ensanchamientos de banda M. Sánchez-CEBI_E1a 13 M. Sánchez-CEBI_E1a 14 Caudal: Volúmen transportado por unidad de tiempo. Q = π r 2 µ Área de sección de la columna Velocidad lineal media de flujo Cromatografía líquida Principales mecanismos de interacción FM-FE: Adsorción superficial Partición Intercambio iónico Exclusión molecular M. Sánchez-CEBI_E1a 15 M. Sánchez-CEBI_E1a 16 Cromatografía: De adsorción: fenómeno superficial, partículas de soluto adsorbidas en la fase estacionaria Adsorción FE: Sólidos muy porosos con capacidad adsorbente Capacidad de carga Sílica Presentaciones Alúmina FM: Solventes orgánicos M. Sánchez-CEBI_E1a 17 M. Sánchez-CEBI_E1a 18

4 Adsorción Solvente y soluto compiten por los sitios de adsorción en la fase estacionaria! Adsorción M. Sánchez-CEBI_E1a 19 M. Sánchez-CEBI_E1a 20 Adsorción La fuerza eluyente ε 0 es la energía de adsorción del disolvente por unidad de superficie (sílica). Adsorción Tipos de rellenos: Esférico Solvente Fuerza de Elución Irregular Fluorcalcanos N-pentano 0.00 N-hexano clorubutano 0.20 Benceno 0.20 Xileno 0.24 Cloroformo 0.26 Tolueno 0.28 Cloruro de metileno 0.32 Acetato de etilo 0.38 Tetrahidrofurano 0.44 Acetonitrilo 0.50 Metanol M. Sánchez-CEBI_E1a M. Sánchez-CEBI_E1a 22 Ejemplo La cromatografía de adsorción es mas adecuada para compuestos no polares (solubilidad limitada en solventes acuosos) con masas moleculares < Que la diferencia de otros métodos?? capacidad de diferenciar isómeros! Separación de cis y trans pirazolina. Columna 100 x 0.3 cm, sílice pelicular. Fase móvil: 50% cloruro de metileno / isooctano. Caudal 0.25 ml/min. Detector UV 254 nm. M. Sánchez-CEBI_E1a 23 M. Sánchez-CEBI_E1a 24

5 reparto Q = π r 2 µ µ=0.06 Los componentes de la mezcla se separan según su distribución entre dos líquidos inmiscibles. FE M. Sánchez-CEBI_E1a 25 OJO!! soporte FE!! Soporte: Sílica finamente particulada (<10 μ) Superficie completamente hidrolizada Fase Unida (o Ligada) Cromatografía en fase reversa M. Sánchez-CEBI_E1a 27 M. Sánchez-CEBI_E1a 28 Cromatografía en fase reversa Fase Ligada THF i-propanol ACETONA ETANOL ACETONITRILO METANOL AGUA LONGITUD DE ONDA MINIMA UV 212 nm 205 nm 330 nm 210 nm 190 nm 205 nm 190 nm INDICE DE REFRACCION FUERZA DE SOLVENTE M. Sánchez-CEBI_E1a 29 Fase reversa Fase normal M. Sánchez-CEBI_E1a C-18 Mas utilizada en RP-HPLC C-8 menor retención que C18 C-3, C-4 Proteínas y péptidos CN NH 2 compuestos de polaridad intermedia hidratos de Carbono 30

6 Ejemplo A: H 2 O B: MeOH % A Efecto de la longitud de la cadena en la eficiencia de las columnas de siloxano en fase inversa empaquetadas con partículas de 5 µm. Fase móvil: 50/50 metanol/agua. Caudal 1 ml/min M. Sánchez-CEBI_E1a 31 M. Sánchez-CEBI_E1a 32 A: H 2 O B: CH 3 CN Aplicaciones tiempo=solvente (=$) resolución de picos mas retenidos Solución: GRADIENTE! M. Sánchez-CEBI_E1a 33 M. Sánchez-CEBI_E1a 34 Analitos ionizables (débiles) Supresión de iones pka=4.6 Menos polar = más retenida Variar ph de FM Supresión de iones Muy polar = menos retenida Par iónico (IPC) proporción de ácido protonado (neutro) M. Sánchez-CEBI_E1a 35 M. Sánchez-CEBI_E1a 36

7 Analitos ionizables Intercambio Iónico Para trabajar con las especies cargadas: : Intercambio Iónico (IEC) Par Iónico (IPC) M. Sánchez-CEBI_E1a 37 Sirve para separar compuestos iónicos (aniones y/o cationes) Soporte: poliestireno o sílica Solvente: buffer (control de ph y fuerza iónica) Mecanismo de separación: intercambio reversible de iones entre el analito y la FE. Intervienen fuerzas electrostáticas. Intercambiador de aniones M. Sánchez-CEBI_E1a Intercambiador de cationes 38 Intercambio Iónico (IEC) Intercambio Iónico: Aplicaciones Intercambiadores fuertes Intercambiadores débiles Cationes y aniones inorgánicos Acidos orgánicos, aminas, carbohidratos, proteínas, etc. OJO: NO SON MOLÉCULAS PEQUEÑAS!! M. Sánchez-CEBI_E1a 39 M. Sánchez-CEBI_E1a 40 Par Iónico Utiliza una columna HPLC de fase reversa. Se añade a la FM un reactivo que se aloja en la FE convirtiéndola en un intercambiador iónico. Los iones del analito se pueden unir a la fase estacionaria por atracción electrostática con los iones del surfactante. Mecanismo de retención: mezcla de interacciones con fase reversa y de intercambio iónico. Fase unida Reactivo de par iónico SO 3 Na + + R SO 3 H N R Muestra R N + N + H 2 PO 4 O O C R M. Sánchez-CEBI_E1a 41 M. Sánchez-CEBI_E1a 42

8 Longitud de cadena del reactivo de par iónico exclusión molecular FE: geles porosos Fundamento de separación: separación en base a forma y tamaño del analito M. Sánchez-CEBI_E1a 43 M. Sánchez-CEBI_E1a 44 exclusión molecular exclusión molecular Muy útil con macromoléculas, Aacs, péptidos, azúcares. M. Sánchez-CEBI_E1a 45 Instrumentación Suministro de solventes: Funciones básicas: Proveer flujo constante y preciso Proveer composiciones precisas de fase móvil Proveer la fuerza necesaria para empujar la FM a través del empaquetamiento compacto de la fase de la columna M. Sánchez-CEBI_E1a 47 M. Sánchez-CEBI_E1a 48

9 Suministro de solventes: Agua, soluciones buffer acuosas y solventes orgánicos tales como metanol, acetonitrilo o diferentes mezclas. Grado HPLC. FM sin elementos particulados. Evitar obstrucciones en el sistema (conexiones muy estrechas, pistones de zafiro y columna muy empaquetada) M. Sánchez-CEBI_E1a 49 Bomba pistón Movimiento del pistón atrás-adelante Sello flexible alrededor de la periferia del pistón (impide la fuga de la FM) Válvulas de retención (flujo unidireccional de disolvente) Variación del flujo M. Sánchez-CEBI_E1a 50 Pistones en paralelo Mientras un cilindro se está llenando, el otro entrega FM. Flujo Combinado Pistones en serie Mientras se llena el pistón grande llena el pequeño entrega FM. Cuando se llena el pequeño, el proporciona FM (para llenar tanto el pistón pequeño y proporcionar un flujo neto hacia la columna) Pistón A Pistón B M. Sánchez-CEBI_E1a 51 M. Sánchez-CEBI_E1a 52 Amortiguador de pulsos Tubo en forma de T Fuelle flexible o gas compresible (absorbe energía de la pulsación) Cuando la bomba se esta llenando, esta energía se libera Reduce el ruido de la bomba Inyector Manual Válvula de 6 vías, con loop de volumen conocido y una palanca con dos posiciones: llenado e inyección Llenado: la FM pasa a la columna y la muestra se introduce en el loop Inyección: la FM impulsa la muestra desde el loop hasta la columna M. Sánchez-CEBI_E1a 53 M. Sánchez-CEBI_E1a 54

10 Inyección manual vs. automática Columnas > precisión Columnas analíticas: Ø interno: 4.6 mm, < 0.1 mg muestra Columnas semipreparativas: Ø interno: 1 a 3 cm, de 1 a 200 mg muestra Columnas preparativas: Ø interno: varios cm. Solo para uso industrial. Requieren equipo especial. Cuidados físicos con la columna: No golpear la columna No dejar secar la columna M. Sánchez-CEBI_E1a 55 M. Sánchez-CEBI_E1a 56 Detectores Basados en una PROPIEDAD física o físico-química DEL SOLUTO (no la presenta la FM). Bastante selectivos y muy sensibles. UV Fluorescencia Electroquímicos Basados en una PROPIEDAD DE LA DISOLUCIÓN comparan el cambio global de alguna propiedad física de la FM con y sin soluto eluido. Responden a un conjunto amplio de solutos. Poco sensibles. Índice de refracción Conductividad M. Sánchez-CEBI_E1a 57 Propiedades del detector Sensibilidad adecuada Respuesta lineal amplia Respuesta rápida y reproducible Manejo sencillo Límite de detección: relación señal/ruido. No solo depende del detector! Límite de cuantificación: límite de concentración más bajo para mediciones cuantitativamente precisas M. Sánchez-CEBI_E1a 58 UV-Visible long. de la celda concentración Detector UV por arreglo de diodos Ley de Beer: A = ɛ l c Va realizando barridos completos del espectro UV-Vis Coeficiente de extinción Permite reprocesar el mismo cromatograma detectando a diferentes λ ɛ sustancia longitud de onda Se analiza una longitud de onda por cada medición Solvente!! Abs Rt λ Se puede obtener el espectro UV-Vis de cada pico del cromatograma y compararlo con una base de datos M. Sánchez-CEBI_E1a 59 M. Sánchez-CEBI_E1a 60

11 Detector de fluorescencia Detectores de índice de refracción Muy sensibles y selectivos. Dos λ de trabajo: -excitación -emisión Para analitos fluorescentes (derivados) Miden variaciones en el RI del analito con respecto al de la FM Sólo se pueden usar si la elución es isocrática Son universales, pero tienen baja sensibilidad M. Sánchez-CEBI_E1a 61 M. Sánchez-CEBI_E1a 62 Detectores de conductividad Aplicaciones: Iones, ácidos, bases y sales Baja sensibilidad Sensibles a impurezas de la fase móvil Detectores electroquímicos Se basan en la reacción redox entre el analito y un electrodo El nivel de reacción es proporcional a la concentración del analito. Se mide y se compara con un electrodo de referencia. M. Sánchez-CEBI_E1a 63 M. Sánchez-CEBI_E1a 64 Detectores por espectrometría de masas Introducción de la FM en cámara de vacío Vaporización previa de solvente Termovaporizadorionizador Aplicable a compuestos termoestables y no volátiles Espectros de impacto electrónico Análisis cualitativo Permite identificar los compuestos individuales en la muestra El parámetro más común es su tiempo de retención Dependiendo del detector utilizado la identificación se puede basar en la estructura química, molecular, peso o algún otro parámetro molecular. M. Sánchez-CEBI_E1a 65 M. Sánchez-CEBI_E1a 66

12 Análisis cuantitativo Detectores dan una respuesta proporcional a la cantidad de sustancia (m): Respuesta = a x m a: característico para cada sustancia Método del estándar externo Se preparan soluciones del estándar de concentración conocida. Se grafica área vs. concentración Como el componente atraviesa el detector en un período de tiempo Área f: factor de respuesta. Cantidad de sustancia por unidad de área Debe verificarse el rango de linealidad de respuesta!! M. Sánchez-CEBI_E1a 67 M. Sánchez-CEBI_E1a 68 Bibliografía The LC Handbook. Guide to LC columns and method development. Agilent Publication number EN. Handbook-Complete-2.pdf Agilent ZORBAX column guide selection. Trends in universal detection in high performance liquid chromatography. Joshi, P. B.; Bhoir, S. I.; Bhagwat, A. M. M. Sánchez-CEBI_E1a 69