CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI

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1 CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Articulación CEBI_A3 QUIMICA ORGANICA DE BIOPROCESOS Docente a cargo: Dra. Silvia Flores CEBI_A3_ 7: Espectrometría de masa

2 Espectrometría de masa Se fundamenta en la separación de partículas moleculares o atómicas por su diferente relación masa/carga (m/z). Comprende cuatro etapas principales: a) Ionización de la muestra. b) Aceleración de los iones por un campo eléctrico. c) Dispersión de los iones según su masa/carga. d) Detección de los iones y producción del espectro a) Ionización de la muestra: A fin de generar iones positivos: M M + (ión molecular ) (m/z, con z=1) y cuyo PM coincide con el PM del compuesto. El M + puede sufrir fragmentaciones selectivas (con m/z < m/z de M + ), que aportan información estructural. Los fragmentos también son iones positivos que son detectados para dar un espectro de Intensidad vs m/z

3 Espectrometría de masa Fuentes de iones Tipo Nombre Agente ionizante Fase gaseosa 1º volatilización 2º ionización Muestras volátiles, termoestables, Ptos de eb. < 500ºC PM < 1000 Dalton Impacto de e - (EI) M (g) + e - M + (g) + 2 e - e - energéticos Ionización química (CI) M (g) + CH 5+ MH + (g) + CH 4 Ionización por campo (FI) Iones gaseosos reactivos (metano + e - : CH 4+, CH 3+, CH 5+, etc.) Electrodo de elevado potencial El IE es una fuente dura de iones: espectros complejos con muchos fragmentos (información estructural). La IC y FI son fuentes blandas de iones: espectros simples con pocos fragmentos (determinación del M + e información del PM).

4 Espectrometría de masa Fuentes de iones Tipo Nombre Agente ionizante Desorción 1º suministro de energía 2º ionización Muestras sólida o líquida, termolábiles, PM >>> 1000 Dalton (Proteínas, enzimas, biopolímeros, ADN, etc). Desorción por campo (FD) Ionización por electronebulización (ESI) Desorción / Ionización asistida por una matriz (MALDI) Desorción por plasma (PD) Bombardeo con átomos rápidos (FAB) Iones secundarios (SIMS) Ionización por termonebulización (ESI) Electrodo de elevado potencial Campo eléctrico elevado Haz de láser Fragmentos de fisión del 252 Cf Haz de átomos energéticos Haz de iones energéticos Elevada temperatura

5 Espectrometría de masa La matriz facilita la desorción e ionización del analito gracias a la absorción de la radiación del láser. Como resultado, matriz y analito son vaporizados. Requisitos para la matriz: - Alta absorción en la λ del láser (UV) - Muy soluble en el solvente (H 2 O / Ol) tal que la concentración sea alta.

6 Espectrometría de masa MALDI La matriz (ácido nicotínico, λ = 266 nm) minimiza los daños de la luz UV sobre la muestra, por lo que casi no existen fragmentos (buena detección del M+). Aparecen iones de carga múltiple (z = 2, 3,..), dímeros y trímeros

7 Espectrometría de masa ESI Se genera un spray que pasa por una diferencia de potencial muy alta para que se carguen las gotitas. Luego se evapora el solvente y el analito cargado.

8 Espectrometría de masa ESI Hay muy poca frangmentación y aparecen picos de z muy altos (z = 30, 40, 50, etc.) por lo que m/z con bajos.

9 Espectrometría de masa b) Aceleración de los iones por un campo eléctrico. c) Dispersión de los iones según su masa/carga. Es equivalente a la separación de longitudes de onda en un monocromador. Algunos sistemas principales: analizador de sector magnético, espectrómetro de doble enfoque, cuadrupolar, de tiempo de vuelo (TOF), de trampa de iones (con TF).

10 Espectrometría de masa d) Detección de los iones y producción del espectro El detector está constituido por un cátodo emisor que al recibir el impacto producido por las partículas cargadas emite electrones. Estos electrones son acelerados hacia un dínodo (similar a un tubos fotomultiplicador para amplificar una corriente eléctrica).

11 Espectrometría de masa Resolución

12 Espectrometría de masa Aplicaciones 1- Elucidación estructural: moléculas pequeñas y macromoléculas 2- Determinación del PM 3- Detección e Identificación de compuestos provenientes de separaciones cromatográficas : capa delgada, HPLC, GC, electroforesis capilar. Técnicas acopladas: LC-MS, GC-MS, MS-MS (introducción directa o desorción). 4- Determinación de secuencias de aminoácidos 5- Identificación de drogas y sus metabolitos (sangre, orina, saliva) 6- Análisis de isótopos: datación de muestras arqueológicas y estudios metabólicos y cinéticos 7- Determinación de residuos de pesticidas en alimentos

13 CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI Materia de Articulación CEBI_A3 QUIMICA ORGANICA DE BIOPROCESOS Docente a cargo: Dra. Silvia Flores CEBI_A3_8: Cromatografía - Aspectos generales

14 Método de separación de mezclas. La mezcla se desplaza en una fase móvil (líquida, gaseosa o fluido supercrítico) a través de una fase estacionaria (líquida o sólida, montada sobre una columna o placa) con la que es inmiscible. Se disponen estas dos fases en contacto y en movimiento una con respecto a la otra. La fase móvil arrastra a los componentes de la mezcla a través de la fase móvil. Los componentes se reparten diferencialmente en cada fase separándose.

15 Clasificación según el tipo de fase móvil y estacionaria. Cada técnica involucra un tipo de equilibrio de transferencia de los componentes entre las fases.

16 Cada componente experimenta un fenómeno de retención diferente. Definiciones: volumen de elución (V R ): vol. de la fase móvil necesario para que un componente atraviese la fase estacionaria contenida en el soporte. Cuanto más retenida esté el componente, mayor será V R t R Tiempo de retención (t R ): tiempo que demora en salir cada componente. A un flujo de fase móvil constante (F), el t R característico de cada componente será t R = V R / F

17 volumen muerto (V M ): vol. de la fase móvil necesario para que un componente No retenido, atraviese la fase estacionaria contenida en el soporte. V M = V est * ε (ε: porosidad) Flujo lineal (u): velocidad a la cual la fase móvil atraviesa la columna a un flujo de fase móvil constante (F). t M tiempo mínimo, por debajo de este valor no saldrá ningún componente. u = L / t M (L: longitud de la fase estacionaria, t M : tiempo mínimo, por debajo de este valor no saldrá ningún componente) Equilibrio de partición: en una sección de la fase estacionaria, las concentraciones de un componente en fase estacionaria y móvil están en equilibrio. K = C est / C móv Además, por BM : V R * C móv = V est * C est + V M * C móv Reemplazando : V R = V est * K + V M de las fase estacionaria, en equil. de adsorción) (V est pude reemplazarse por el A

18 Eficiencia de la columna Número efectivo de platos (N EP ): número de veces que se produce el equilibrio de partición para que un componente sea separado. N EP = L / H = [(t R t M ) / σ] 2 (H: altura del plato)

19 Picos asimétricos Aparece por deficiente sembrado de la muestra, saturación o inhomogeneidades en la fase estacionaria.

20 Dispersión en los t R (ancho de bandas) Causas: (A) Flujo no uniforme (convección): La dispersión de la fase estacionaria puede generar recorridos de longitud variable para la fase móvil. Múltiples trayectorias aleatorias Dependerá del tamaño de las partículas y de la uniformidad de la densidad del empaque. No depende del flujo (F). (B/u) Difusión longitudinal: Generada por gradientes de concentración preesentes durante la separación. Dependerá de la difusión de los solutos en la fase móvil (viscosidad). Si t R es alto o F es bajo, efectos difusivos toman relevancia. (C*u) Transferencia de masa: Se refiere al efecto que produce el hecho de que existe un t finito para que se establezca el equilibrio de reparto. Si la cinética de reparto es lenta, el proceso de equilibrio se dificulta. A mayor velocidad o a altas viscosidades de flujo (fase móvil), mayor será el ensanchamiento. A mayor uniformidad, porosidad y menor tamaño de las partículas de la fase estacionaria, menor será el ensanchamiento.

21 Ecuación de Van Deemter Relaciona las causas de ensanchamiento de bandas con la altura del plato (H): H = A + B / u + C * u (A, B y C: constantes características para una dada columna y sv.) u óptimo

22 Resolución Capacidad para resolver o discriminar entre dos componentes de la mezcla. Se define como el cociente de la separación entre picos y el promedio de sus anchos R s = t R / W - En términos de la eficiencia R s = (N ER ) 1/2 / 4 * [1-t R(1) / t R(2) ] - En términos de la selectividad y capacidad R s = (L/H) 1/2 * 1/ 4 * [(α-1) / α] * [k promedio / (1+ k promedio )] eficiencia selectividad capacidad Donde: capacidad: k = K * V est / V M (compara t R con t M ) selectividad: α = k 2 / k 1 (retención relativa)

23 Resolución

24 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 1) Adsorción Fase estacionaria en estado sólido. Compiten las moléculas de la fase móvil y el componente por los sitios de adsorción de la fase estacionaria (Sílice, Alúmina, carbón).

25 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 1) Adsorción Solvente de polaridad baja a intermedia. A mayor polaridad del sv. Mejor desplazamiento del analito (menor t R ) Fuerza del disolvente (ε 0 ): energía de adsorción de la fase móvil por unidad de área de fase estacionaria (k es directamente proporcional a ε 0 )

26 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 1) Adsorción A fin de lograr diferentes valores de, se emplean mezclas de sv. Requisitos: - Volatilidad alta - Baja viscosidad - Pureza, humedad, composición reproducibles - Baja toxicidad - Bajo costo - Ejs: hexano:acetato de etilo, Diclorometano:metanol, Tolueno:metano Algunas aplicaciones: - Compuestos aromáticos en petróleo - Triglicéridos en extractos lipídicos - Carotenoides y porfirinas de extractos vegetales - Drogas de abuso y fármacos psicoactivos - Micotoxinas

27 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 2) Partición Fase móvil líquida unida a un soporte. Los enlaces siloxano son muy estables en un amplio rango de ph (2-8)

28 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 2) Partición Solvente depende del tipo de fase enlazada. Importante: el ph de la fase móvil no debe inducir cargas en grupos ionizables. (supresión de iones por medio de agregado de buffers en pequeñas cantidades). Distintos esquemas: - Formas normales Fase móvil poco polar (sv no polar) - Formas reversas Fase móvil polar (agua + sv menos polar, MeOH, dioxano, MeCN) Ampliamente usada, más importante y común. Más versátil ya que las interacciones intermoleculares del analito se dan principalmente con la fase móvil, se fundamente en interacciones del tipo hidrofóbicas.

29 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 3) Formación de pares iónicos Se agrega un surfactante iónico a la fase móvil con esquema reverso. Factores que afectan la retención: Grado de ionización del analito (ajuste de ph de la fase móvil) Naturaleza del surfactante (aniónico, catiónico, longitud e la cadena) Composición de la fase móvil.

30 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 4) Intercambio iónico Se emplean grupos ionizables unidos covalentemente a la fase estacionaria.

31 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 4) Intercambio iónico Equilibrio involucrado: Influyen: carga, solvatación, polarizabilidad Distribución del ión entre las fases D = [X+] resina / [X+] = k X/H * [H+] resina / [H+] En condiciones estandarizadas se puede obtener una selectividad α = D 2 / D 1 Aplicaciones para separación de moléculas de variado PM: - aa y ácidos débiles - Nucleótidos - Proteínas

32 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 5) Permeación por geles Fase móvil, sin requerimientos particulares, salvo disolver la muestra. Fase estacionaria es un polímero entrecruzado con poros de tamaño molecular

33 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 5) Permeación por geles Se pueden relacionar tres tipos de volúmenes, componentes del volumen de lecho de separación: Volumen de poro (V p ) Volumen de muerto(v M ) Volumen de la fase estacionaria (V est ) V eluc = V M + K * V est Importante: Minimizar las interacciones específicas entre la FE y el analito Considerar la formación de agregados por parte del analito La retención depende del radio hidrodinámico

34 Tipos de fenómenos en la fase estacionaria 6) Cromatografía de afinidad. Fase estacionaria retiene a los componentes e la mezcla mediante formación selectiva de complejos. - Inhibidores (enzimas) - Ligandos específicos como esteroides (receptores intercelulares) - Antígenos (anticuerpos)